紫蘇發酵乳體外抗氧化活性的研究

2019-07-30 02:00:20田海娟羅佳孫宇張傳智潘艷張艷

中國乳品工業 2019年6期

田海娟，羅佳，孫宇，張傳智，潘艷，張艷

（1.吉林工商學院糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春1300507；2.吉林工商學院糧食學院，吉林長春 130507）

0 引言

紫蘇(Perilla frutescens(L.)Britt，我國研究紫蘇已有20多年的歷史，紫蘇籽提油后的紫蘇餅粕中含有豐富的活性成分，如α-亞麻酸、亞油酸、油酸、蛋白質及氨基酸[1]，另外還含有膳食纖維、谷維素、維生素F、維生素B1、甾醇、磷脂等。目前紫蘇籽粕主要用作飼料，對紫蘇籽粕中營養成分的利用率較低，造成了浪費。開菲爾(Kefir)是一種以牛乳或羊乳為原料，利用開菲爾粒發酵制得的復合型發酵乳。其軍種為Kefir顆粒，是一個復雜的微生物共生體系，主要由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的某些屬種組成[2]。開菲爾發酵乳具有緩解乳糖不耐癥、調節胃腸道功能、刺激免疫系統和加速膽固醇代謝等功效[3]。開菲爾有很多潛在功效，為今天備受青睞的健康食品開發提供新的思路。用開菲爾菌加工紫蘇籽粕發酵乳，可以得到效用更高，且具有紫蘇特有香味的風味發酵乳。

目前，對紫蘇抗氧化性的相關研究很多，但大多集中在其根、莖、葉中[4-7]。從自由基這方面來研究食物的營養與食療效用，具備重要的理論意義和普遍的應用價值。羥基自由基（·OH）是活性氧中最活潑的自由基之一，對人體的毒性相當大，可以直接損傷各種生物膜，使得多種疾病并發，從而危及生物體[8]。DPPH（分子式C12H12N6O6，Mr=394.32）自由基是一種人工合成的有機自由基，性質穩定。其乙醇溶液呈深紫色，并在515～520 nm有最大吸收峰。在DPPH溶液中加入自由基清除劑，深紫色溶液褪成黃色，其褪色程度與自由基所接受的電子數量成定量關系，因此能夠通過溶液吸光度的變化來進行定量分析[9]。試驗以提油后的紫蘇籽粕為原料，經低溫超微粉碎，用開菲爾菌作為發酵劑，制備紫蘇發酵乳，以·OH清除率、DPPH自由基清除率為指標，研究紫蘇發酵乳體外抗氧化活性的規律，為高效利用紫蘇籽粕，開發品質穩定性較高的紫蘇健康食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫蘇籽：洮南市百群食品科技有限公司；純牛奶：廣澤乳業有限公司；纖維素酶：河南祥盛食品配料有限公司；開菲爾菌：北京川秀科技有限公司；DPPH：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：北京化工廠，分析純；硫酸亞鐵：天津市光復科技發展有限公司，分析純；過氧化氫：開原化學試劑一廠，分析純；水楊酸：天津市華東試劑廠，分析純。

1.1.2 主要儀器設備

4A220-50-06超臨界萃取裝置，江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司；SQW-601三清超微粉碎機，濟南易辰超微粉碎技術有限公司；LBJ-625A食品粉碎器，廣東洛貝電子科技有限公司；HH-2K4二列四孔水浴，鞏義市予華儀器有限責任公司；Agilent Cary 60 UV-Vis紫外-可見分光光度計，美國安捷倫科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 開菲爾菌擴大培養

用蒸餾水沖洗開菲爾菌，至其潔凈，置于玻璃杯中，向其中倒入純牛奶，漫過菌種，蓋上紗布，套上橡皮筋，置于恒溫培養箱中，30℃培養24 h。

1.2.2 原料預處理

紫蘇籽經超臨界CO2技術（壓力：25 MPa，溫度：40℃，流量：20 L/h，1 L萃取釜萃取90 min）萃取紫蘇籽油，剩下的紫蘇籽粕經超微粉碎處理，冷凍保藏。將適量紫蘇粕置于粉碎器中粉碎，然后過80目篩，冷藏。在燒杯中加入20 g紫蘇籽粕，再用200 g水將其溶解，并添加一定量的纖維素酶，攪拌均勻，置于60℃水浴鍋中酶解。3 h后取出，靜置。

1.2.3 單因素與正交試驗設計

取一定量的紫蘇酶解液，再加入開菲爾菌、蔗糖，加牛奶至50 mL，攪拌均勻，于25℃恒溫培養箱中培養一定時間，取出后將發酵乳過濾，回收開菲爾菌、重復利用。控制蔗糖添加量為12%，酶解液含量為25%，培養時間12 h，開菲爾菌接種量分別設為4%、6%、8%、10%、12%，培養紫蘇發酵乳。控制開菲爾菌接種量為8%，酶解液含量為25%，培養時間12 h，蔗糖添加量分別為8%、10%、12%、14%、16%，培養紫蘇發酵乳。控制開菲爾菌接種量為8%，蔗糖添加量為12%，培養時間12 h，酶解液含量分別為15%、20%、25%、30%、35%，培養紫蘇發酵乳。控制開菲爾菌接種量為8%，蔗糖添加量為12%，酶解液含量為25%，培養時間分別設為8 h、10 h、12 h、14 h、16 h，培養紫蘇發酵乳。由于各因素條件在實際發酵酸奶時會相互影響，所以根據單因素試驗結果，設計正交試驗，通過正交試驗確定紫蘇發酵乳體外抗氧化活性的最佳工藝組合。

1.2.4 抗氧化活性測定

（1）羥基自由基清除率的測定。

稱取0.1668 g七水硫酸亞鐵顆粒，用蒸餾水定容至100 mL，得到濃度為6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液；量取30%的過氧化氫0.06 mL加水配制成100 mL的6 mmol/L的雙氧水溶液；稱取0.0829 g水楊酸用無水乙醇溶解，定容至100 mL，得到6 mmol/L的水楊酸溶液。

參考彭惠惠[10]等人的方法，在1.5 mL離心管中依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液300μL、紫蘇發酵乳樣品300μL、6 mmol/L過氧化氫溶液300μL，搖勻，靜置10 min后再加入6 mmol/L水楊酸溶液300μL，搖勻，靜置30 min，然后在510 nm波長下測其吸光度。做平行試驗重復測定3次。

式中：A0為不加發酵乳樣品液的本底吸光度；AS為加入發酵乳樣品液反應后的吸光度；Ax為不加水楊酸溶液的吸光度。

（2）DPPH自由基清除率的測定[11]。

準確稱取0.8 mg DPPH，用無水乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液。利用DPPH溶液在517 nm下具有最大的紫外吸收峰，測定加入紫蘇發酵乳樣品后A517 nm吸收的下降表示其清除DPPH自由基的能力。

取400μL的發酵乳樣品于1.5 mL離心管中，再加入2×10-4mol/L的DPPH無水乙醇溶液400μL，混勻，室溫避光反應30 min，然后測定波長517 nm處的吸光度Ai，同時測定400μL發酵乳樣品液+400μL無水乙醇混合后的吸光度Ai和400μL DPPH無水乙醇溶液+400μL無水乙醇的吸光度A0。做平行試驗重復測定3次。

1.3 數據分析與處理

圖表中數據為三次平行試驗檢測數據的平均值，誤差為標準偏差。所得數據用Microsoft Excel軟件進行計算、制圖整理，用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 紫蘇粕發酵乳單因素試驗結果與分析

2.1.1 開菲爾菌接種量對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

圖1 接種量對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

由圖1可得，未接種開菲爾菌的紫蘇發酵乳與開菲爾菌接種量為4%的紫蘇發酵乳的羥基自由基清除率相差不大，DPPH自由基清除率也相差不大。接種后，隨著接種量的增加，發酵乳的·OH清除率和DPPH自由基清除率均急劇提高再降低。當開菲爾菌接種量為10%時，·OH清除率最高，為（95.31±25.96）%；當開菲爾菌接種量為8%時，紫蘇發酵乳的DPPH自由基清除率最高，為（89.47±5.16）%。推測可能是因為紫蘇發酵乳中接入的開菲爾菌對其抗氧化性有協同提高作用。試驗選取開菲爾菌接種量6%、8%和10%作為正交試驗中該因素的3個水平。

2.1.2 加糖量對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

圖2 加糖量對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

蔗糖具有還原性可被氧化，具有一定的抗氧化能力，所以選取該因素進行單因素試驗。由圖2可得，試驗制備的發酵乳用開菲爾作為發酵劑，在發酵過程中產生大量乳酸而導致產品口感過于酸，課題組經過反復試驗，確定了加糖量的適宜范圍為10%左右，為進一步研究加糖量對發酵乳體外抗氧化性的影響，單因素擴大了加糖量的范圍至16%。隨著加糖量的增多，紫蘇發酵乳的·OH清除率急劇增大又減小，當加糖量為12%時，·OH清除率最高：（95.52±2.53）%，加糖量從12%增至14%時，·OH清除率迅速降低，加糖量增至16%時，與加糖量為14%時相比略有提高，但相差不大；隨著加糖量的增多，紫蘇發酵乳的DPPH自由基清除率迅速增大又漸趨平緩，加糖量為14%時，DPPH自由基清除率最高，為（71.79±3.16）%。所以猜測，加糖量較多時可以提高紫蘇發酵乳的抗氧化性。試驗選取加糖量12%、14%和16%作為正交試驗中該因素的3個水平。

2.1.3 酶解液含量對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

圖3 酶解液含量對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

由圖3可得，隨著發酵乳中紫蘇酶解液含量的增加，紫蘇發酵乳的·OH清除率急劇增大又迅速減小，當紫蘇酶解液含量為25%時，·OH清除率最高，為（90.94±0.26）%；酶解液的含量從15%升到20%時，紫蘇發酵乳的DPPH自由基清除率迅速提高了將近35%，之后隨著酶解液含量的增加，DPPH清除率逐漸提高再降低，當紫蘇酶解液含量為30%時，DPPH清除率最高，為（80.20±0.27）%。所以推測紫蘇酶解液的加入可以提升紫蘇發酵乳的抗氧化性。試驗選取酶解液含量25%、30%和35%作為正交試驗中該因素的3個水平。

2.1.4 培養時間對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

由圖4可得，隨著培養時間的延長，紫蘇發酵乳的·OH清除率迅速升高又急劇降低，當培養時間為12 h時，·OH清除率最高，為（45.75±3.57）%；培養時間從8 h延長至10 h，紫蘇發酵乳的DPPH自由基清除率急劇增加，之后隨著培養時間的延長，DPPH自由基清除率緩緩降低，所以，當培養時間為10 h時，DPPH自由基清除率最高，為（73.87±0.59）%。在發酵過程中，開菲爾菌也會吸收營養、生長擴大，所以推測隨著培養時間的延長，大量營養物質被開菲爾菌代謝，影響了紫蘇發酵乳的抗氧化活性。試驗選取培養時間10 h、12 h和14 h作為正交試驗中該因素的3個水平。

圖4 培養時間對紫蘇粕發酵乳體外抗氧化性的影響

2.2 正交試驗結果及分析

由于各因素對紫蘇發酵乳體外抗氧化活性的影響并不是單一線性的，實際上是受到開菲爾菌接種量、加糖量、紫蘇酶解液含量和培養時間4個因素交叉影響，為了考察這4個因素對紫蘇發酵乳抗氧化活性的交互影響，設計了正交試驗（L9（34））進行實驗，以紫蘇發酵乳的羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率為試驗指標，正交試驗因素和正交試驗結果及極差分析見表1、表2，·OH清除率和DPPH自由基清除率的方差分析見表3、表4。

由表2可得，在正交試驗的各因素中，酶解液含量、培養時間、開菲爾菌接種量、加糖量對紫蘇發酵乳的抗氧化活性影響依次增大。通過比較指標總和與各因素的關系可看出影響紫蘇發酵乳抗氧化活性的最佳的工藝條件組合是A3B1C2D1，即開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，紫蘇酶解液含量30%，培養時間10 h。

對正交試驗結果進行方差分析（P＜0.05），由表3可得，在正交試驗的各因素中，加糖量對紫蘇發酵乳的羥基自由基清除率有顯著影響（P＜0.05）。由表4可得，在正交試驗的各因素中，開菲爾菌接種量、加糖量對紫蘇發酵乳的DPPH自由基清除率有顯著影響（P＜0.05）。

表1 正交試驗因素及水平

2.3 驗證試驗及結果

將正交試驗所得的最佳工藝條件組合進行驗證，在開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，紫蘇酶解液含量30%，培養時間10 h的工藝條件下制備紫蘇發酵乳，測定其·OH清除率、DPPH自由基清除率，做三組平行試驗進行驗證，所得·OH清除率平均值、DPPH自由基清除率平均值分別為（97.64±0.63）%和（97.90±0.69）%。所以，開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，酶解液含量30%，培養時間10 h即為比較穩定的較優生產條件。

3 結論

以提油之后的紫蘇籽粕為原料，以開菲爾菌發酵紫蘇酶解液，以羥基自由基（·OH）清除率、DPPH自由基清除率為考察指標，采用單因素法和正交試驗法，對紫蘇發酵乳的體外抗氧化活性工藝進行優化，研究了開菲爾菌接種量、加糖量、紫蘇酶解液含量、培養時間對紫蘇發酵乳的羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率的影響，結果表明：加糖量對紫蘇發酵乳的羥基自由基清除率有顯著影響（P＜0.05），開菲爾菌接種量、加糖量對紫蘇發酵乳的DPPH清除率有顯著影響（P＜0.05）。所以，紫蘇發酵乳的抗氧化活性的最佳生產工藝條件為：開菲爾菌接種量10%，加糖量12%，紫蘇酶解液含量30%，培養時間10h，在此條件下所得紫蘇發酵乳的抗氧化活性較高。