長壽老人腸道乳酸菌的分離鑒定及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

董蘊(yùn)，崔夢君，單春會，蔡文超，張振東，郭壯

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003）

0 引 言

近年來，越來越多的研究表明膳食[3]、健康狀況[3]、食用益生菌[4]和地域[5]等因素均顯著影響宿主腸道菌群的構(gòu)成，同時(shí)乳酸菌作為健康長壽老人腸道中的優(yōu)勢細(xì)菌之一，對宿主的營養(yǎng)代謝具有積極的作用[1-2]，因而開展長壽老人腸道源乳酸菌的分離鑒定具有一定意義。在賦予產(chǎn)品益生特性的同時(shí)[6]，乳酸菌發(fā)酵亦賦予了乳制品獨(dú)特的風(fēng)味和滋味，研究人員常采用電子鼻[7]和電子舌[8]技術(shù)對食品的風(fēng)味和滋味品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，兩種技術(shù)相結(jié)合更是廣泛的應(yīng)用于發(fā)酵乳品質(zhì)的綜合評價(jià)中[9]。

本研究對長壽老人糞便樣品中的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定，同時(shí)采用電子鼻和電子舌技術(shù)對其分離株制備發(fā)酵乳風(fēng)味和滋味品質(zhì)進(jìn)行了評價(jià)，以期為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器設(shè)備

1.1.1 材料

脫脂牛乳粉，蔗糖。

生化試劑：MRS培養(yǎng)基、Luria-Bertani培養(yǎng)基和石蕊牛乳培養(yǎng)基；dNTP Mix、2×PCR mix，pMD18-T克隆載體，DNA聚合酶，溶菌酶和蛋白酶K；引物27F/1495R；AxyPrep PCR清潔試劑盒。

普通化學(xué)試劑：三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、氯仿、異戊醇、甘油、氯化鈉、陰離子溶液、陽離子溶液、參比溶液、內(nèi)部液和十六烷基三甲基溴化銨（hexadecy1 trimethylammonium bromide，CTAB）。

1.1.2 設(shè)備

HP-01無油真空泵，ECLIPSE Ci生物顯微鏡，DG250厭氧工作站，英國Don Whitley公司UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，DYCP-31D型水平式電泳槽，vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，美國AB公司；TDL-40B低速大容量離心機(jī)，PEN 3電子鼻，德國Airsense公司SA-402B電子舌，日本Insent公司LRH-150生化培養(yǎng)箱。

1.2 樣品的采集

從襄陽市襄城區(qū)龐公雪美養(yǎng)老公寓和漢丹社區(qū)招募6名健康老人志愿者，其中4女2男，年齡在90～94歲之間，身體相對健康，無藥物依賴史，使用行走輔助器可行走，近兩周未服用藥物且未接受過腸道手術(shù)。于老人用便桶內(nèi)放置經(jīng)紫外線照射過的食品專用袋，用無菌采樣勺將樣品采集于無菌離心管中，放入裝有冰袋的樣品采集箱中快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理。

1.3 乳酸菌的分離與鑒定

按照以下步驟進(jìn)行乳酸菌菌株的分離和基因組提?。海?）將采集好的樣品每份稱取10 g后加40 mL質(zhì)量濃度為0.85%的生理鹽水震蕩均勻，400 rpm離心10 min；（2）取上清液1 mL于石蕊牛乳中富集24 h后進(jìn)行樣品梯度稀釋；（3）取-5和-6梯度的稀釋液在含有CaCO3的MRS培養(yǎng)基中涂布，放置于37℃厭氧工作站（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 85%N2，5%CO2及 10%H2）培養(yǎng) 48 h后；（4）挑選有透明圈的單個(gè)菌落在MRS培養(yǎng)基中純化3代后用30%的甘油凍存于-80℃?zhèn)溆?；?）選取過氧化物酶陰性，革蘭氏染色為陽性的菌株暫定為疑似乳酸菌桿菌；（6）采用CTAB法提取分離株的基因組DNA[10]，將提取的基因組DNA在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上跑膠檢測。

按照以下步驟進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增和菌株鑒定：（1）檢測合格后的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，。擴(kuò)增體系為為：正向引物27F為0.5μL，反向引物1495R為 0.5μL，10×PCR Buffer為 2.5μL，dNTP Mix為2μL，DNA聚合酶為0.2μL，DNA模板為1μL，加超純水至25μL。；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min 30 s，循環(huán) 30次；72℃延伸 10 min，4℃保溫[11]。；（2）將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳槽跑膠，染色15 min后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察；（3）將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收清潔后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和鑒定，挑出陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序；（4）將測序所得的序列整理后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性分析比對，并應(yīng)用Mega7.0軟件中的鄰接法（Neighbour-Joining method，NJ）構(gòu)建構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，步長值設(shè)為1000，進(jìn)而判定分離菌株的分類地位。

1.4 乳酸菌分離株發(fā)酵乳的制備

菌液的制備：將制備發(fā)酵乳的菌株在MRS培養(yǎng)基中活化3代后，3 000 rpm離心10 min后棄上清，加入5 mL脫脂乳混勻。

發(fā)酵乳的制備：將脫脂牛乳粉、蔗糖和水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.5%，6.5%和82.0%）混合均勻，65℃水合30 min后，95℃5 min水浴殺菌并冷卻至常溫。按照5×106mL－1復(fù)原乳的比例接入菌液，42℃發(fā)酵24 h后4℃后熟24 h，備用。

1.5 乳酸菌分離株制備發(fā)酵乳風(fēng)味和滋味品質(zhì)的評價(jià)

將15 g發(fā)酵乳樣品置于樣品瓶中，55℃水浴10 min后冷卻至室溫備用。參照楊成聰?shù)姆椒ㄊ褂秒娮颖沁M(jìn)行發(fā)酵乳風(fēng)味品質(zhì)的評價(jià)[12]。

將50 g發(fā)酵乳樣品加入100 mL的去離子水后，10 000 r/min離心5 min，上清液過中速濾紙抽濾后備用。參照文獻(xiàn)[13]中方法使用電子舌進(jìn)行發(fā)酵乳滋味品質(zhì)的評價(jià)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用曼-惠特尼（Mann-Whiney）檢驗(yàn)對L.fermentum和L.salivarius制備發(fā)酵乳各風(fēng)味和滋味指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，使用主成分分析（principal component analysis，PCA）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對L.fermentum和L.salivarius制備發(fā)酵乳品質(zhì)的差異性進(jìn)行評價(jià)。使用Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用SAS9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 長壽老人腸道乳酸菌的分離與鑒定

從襄陽長壽老人的腸道中總共分離出了23株疑似乳酸菌菌株，菌落的形態(tài)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)乳白色、表面光滑且有透明圈。菌落的直徑集中在0.5～1.5 mm。菌株在革蘭氏染色后均呈現(xiàn)為革蘭氏陽性，過氧化氫實(shí)驗(yàn)均為陰性，菌株形態(tài)有桿狀和球狀兩種類型。在對乳酸菌菌株進(jìn)行分離的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步使用CTAB法對其DNA進(jìn)行了提取，23株疑似乳酸菌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

圖1 疑似乳酸菌基因組DNA的電泳結(jié)果

圖 1中，M為 DL15000 DNA Marker；泳道1～-8為菌株HBUAS54075-菌株HBUAS54082；泳道9～16為菌株HBUAS54084-菌株HBUAS54091；泳道17～22為菌株HBUAS54099-菌株HBUAS54104；泳道23為菌株HBUAS54106。下同。

由圖1可觀察到各菌株在15 000 bp上方出現(xiàn)一條熒光條帶，而條帶的亮度不同則顯示出了所提DNA的濃度的不同。經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)所有菌株的亮度都能夠滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增的需要。疑似乳酸菌16Sr DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 乳酸菌16SrDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

由圖2可觀察到所有泳道均出現(xiàn)熒光條帶，且大小均在1500 bp左右的位置，亮帶并無拖尾現(xiàn)象。由此可見，疑似乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增較為成功，擴(kuò)增產(chǎn)物可進(jìn)行后續(xù)的研究。經(jīng)清潔、連接、建克隆和測序后，本研究將23株疑似乳酸菌的16SrDNA序列進(jìn)行了同源性分析，并與模式菌株一起進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖3所示。

圖3 乳酸菌16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖3可看出：菌株HBUAS54087，HBUAS54086，HBUAS54106，HBUAS54077，HBUAS54104，HBUAS54081，HBUAS54091，HBUAS54088和HBUAS54085與模式株L.fermentum CIP102980形成了第一類群，因而鑒定為L.fermentum（發(fā)酵乳桿菌）；菌株HBUAS54099、HBUAS54100、HBUAS54102、HBUAS54103、HBUAS54076和HBUAS54090與模式菌株L.mucosae JCM 12515形成了第二類群，因而鑒定為L.mucosae（黏膜乳桿菌）；菌株HBUAS54089，HBUAS54075，HBUAS540 84，HBUAS54080，HBUAS54078和HBU AS54082與模式菌株L.salivarius ATCC11 741形成了第三類群，因而鑒定為L.salivarius(唾液乳桿菌)；菌株HBUAS54079與模式菌株L.garvieae JCM 12256形成了第四類群，因而鑒定為L.garvieae（格氏乳桿菌）；菌株HBUAS54101與模式菌株Enterococcus feacium DSM 20477形成了第五類群，因而鑒定為E.feacium（屎腸球菌）。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，23株乳酸菌中分別有9株鑒定為L.fermentum，6株鑒定為L.salivarius，分別占分離株總數(shù)的39.1%和26.1%。由此可見，L.fermentum和L.salivarius為襄陽地區(qū)長壽老人腸道中的優(yōu)勢乳酸菌類群。值得一提的是，23株乳酸菌菌株與模式菌株的序列同源性均達(dá)到了99%以上，且呈現(xiàn)出明顯的聚類趨勢，因而本研究的序列分析結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。

2.2 乳酸菌分離株制備發(fā)酵乳風(fēng)味品質(zhì)的評價(jià)

在對襄陽地區(qū)長壽老人腸道中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，本研究選取可用于食品加工的L.salivarius和L.fermentum進(jìn)行了發(fā)酵乳的制備，同時(shí)采用電子鼻技術(shù)對風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了評價(jià)。各傳感器對兩類乳酸菌菌種制備發(fā)酵乳響應(yīng)值的差異性分析如表1所示。

由表1可以看出，各傳感器對L.salivarius和L.fermentum制備的發(fā)酵乳響應(yīng)值差異均不顯著（P＞0.05），因而兩類乳酸菌菌種制備的發(fā)酵乳風(fēng)味無明顯差異。

2.3 乳酸菌分離株制備發(fā)酵乳滋味品質(zhì)的評價(jià)

本研究進(jìn)一步使用電子舌對兩類乳酸菌菌種制備發(fā)酵乳各滋味指標(biāo)進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 L.salivarius和L.fermentum制備發(fā)酵乳各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度的箱型

由圖4可以看出，L.salivarius制備的發(fā)酵乳澀味顯著高于L.fermentum（P＜0.05），而兩類乳酸菌菌種制備發(fā)酵乳樣品的酸味、苦味、咸味、鮮味、后味A（澀味的回味）、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 PCA乳酸菌分離株制備發(fā)酵乳品質(zhì)的評價(jià)

本研究在使用電子鼻和電子舌技術(shù)對15個(gè)長壽老人腸道源乳酸菌制備發(fā)酵乳風(fēng)味和滋味品質(zhì)進(jìn)行比較分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了15行×18列的矩陣，同時(shí)使用PCA對L.salivarius和L.fermentum制備的發(fā)酵乳的品質(zhì)進(jìn)行了評價(jià)。經(jīng)PCA發(fā)現(xiàn)，信息主要集中在前4個(gè)主成分（principal component，PC），其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.86%，其中，PC1的方差貢獻(xiàn)率為41.03%，PC2的方差貢獻(xiàn)率為25.01%。

表1 各傳感器對L.salivarius和L.fermentum制備發(fā)酵乳響應(yīng)值的差異性分析

圖5 基于PCA L.salivarius和L.fermentum制備發(fā)酵乳品質(zhì)的因子載荷

由圖5可以看出，PC1主要由W1C，W3C，W5C，W6S，W2W，W2S和W1S 7個(gè)指標(biāo)組成，PC2主要由酸味、澀味、咸味和豐度（鮮味的回味）4個(gè)指標(biāo)組成，且W 1C，W3C和W 5C 3個(gè)對芳香物質(zhì)敏感的傳感器分布在X軸負(fù)方向，而酸味分布在Y軸正方向，因而在空間排布上分布于第二象限的發(fā)酵乳樣品具有較佳的品質(zhì)，其對應(yīng)的乳酸菌菌株亦具有優(yōu)良的牛乳發(fā)酵特性。因子得分如圖6所示。

圖6 PCA L.salivarius和L.fermentum制備發(fā)酵乳品質(zhì)的因子得分

由圖6可以看出，L.salivarius和L.fermentum制備的發(fā)酵乳在空間排布上呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，這說明兩類乳酸菌菌種制備發(fā)酵乳的品質(zhì)存在明顯差異，經(jīng)MANOVA發(fā)現(xiàn)，其差異非常顯著（P＜0.01）。結(jié)合圖5可知，分布于第二象限的發(fā)酵乳樣品具有較佳的品質(zhì)，因而本研究分離的L.salivarius牛乳發(fā)酵特性要優(yōu)于L.fermentum。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，L.fermentum和L.salivarius為襄陽地區(qū)長壽老人腸道中的優(yōu)勢乳酸菌類群。經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)，兩類乳酸菌制備發(fā)酵乳的品質(zhì)存在明顯差異，結(jié)合主成分分析發(fā)現(xiàn)，L.salivarius制備的發(fā)酵乳整體風(fēng)味品質(zhì)要優(yōu)于L.fermentum，因而本研究分離的L.salivarius牛乳發(fā)酵特性要優(yōu)于L.fermentum。