CHAC1基因沉默SU-DHL-8細(xì)胞株的構(gòu)建及其對青蒿素細(xì)胞毒活性的影響

王 寧，楊春菊，何麗囡，樊保敏，曾廣智，尹俊林

(云南民族大學(xué) 云南民族大學(xué)-香港浸會大學(xué)傳統(tǒng)天然藥物研發(fā)聯(lián)合實(shí)驗室,云南 昆明 650500)

青蒿素(artemisinin)是一種來源于黃花青蒿(ArtemisiaannuaL.)的含過氧橋的倍半萜內(nèi)酯，其被廣泛用來治療多藥耐藥株惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起的瘧疾[1].近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物可以抑制腫瘤細(xì)胞，包括人白血病細(xì)胞株[2]、結(jié)腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟癌細(xì)胞系，其中對白血病和結(jié)腸癌細(xì)胞株具有較高的抑制活性[3].

彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphomas，DLBCL)是一種主要發(fā)生在淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，是非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin造血系統(tǒng)的惡性腫瘤 L，NHL)中的一種主要亞型，約占所用非霍奇金淋巴瘤的三分之一[4].彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤主要有3種亞型，分別為預(yù)后較好的表達(dá)正常生發(fā)中心B細(xì)胞特征基因的生發(fā)中心B細(xì)胞樣型(GCB)；預(yù)后較差，表達(dá)活化的外周血B細(xì)胞和漿細(xì)胞特征基因的活化B細(xì)胞型樣(ABC)；第3型為無明確特征的異源性類型，預(yù)后較差.目前，使用標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案利妥昔單抗+CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)后，DLBCL 患者的 4 年總生存率為 60%～70%，但仍有30% 的患者產(chǎn)生耐藥或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[5]，因此急需尋找新的治療藥物來提高復(fù)發(fā)難治性DLBCL 患者的生存率.

陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白樣蛋白1(CHAC1)是細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞中高度保守的蛋白質(zhì)，據(jù)報道CHAC1是ATF4/ATF3/CHOP途徑下游的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，是一種新型的促凋亡因子，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER)中的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)[6-7].最近的一些報道還表明CHAC1消耗細(xì)胞中的谷胱甘肽(GSH)，且在此過程中具有γ-谷氨酰基環(huán)轉(zhuǎn)移酶活性[8-9].谷胱甘肽作為抗氧化劑調(diào)節(jié)細(xì)胞中的氧化平衡，而CHAC1蛋白的過表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽過度消耗，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)活性氧過度積累，從而促進(jìn)細(xì)胞的死亡.然而，CHAC1在青蒿素引起的彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步了解.

青蒿素的抗腫瘤作用是目前研究的一個熱點(diǎn)，為了進(jìn)一步探究青蒿素誘導(dǎo)的彌散性大 B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖抑制過程中CHAC1基因作用及相關(guān)機(jī)理，我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染的手法，獲得了沉默CHAC1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并利用沉默CHAC1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，初步探討了CHAC1基因在青蒿素抑制彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖中的作用，為青蒿素引起的彌散性大 B 細(xì)胞淋巴瘤的增殖抑制作用機(jī)理及難治型DLBCL新藥的開發(fā)提供了新的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗所用的細(xì)胞株

SU-DHL-8(人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)來源于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司.

1.2 試劑、藥品

1640培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺購自以色列Biological industries公司；MTT粉末購自美侖生物公司；30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris(PH 8.8)、1.5 mol/L Tris(pH 6.8)、甘氨酸均購自生工生物有限公司；TEMED購自上海BBI 生命科學(xué)有限公司；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Millipore生物公司；青蒿素購自上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；CHAC1兔源一抗(ab76386)購自abcam生物公司；HRP標(biāo)記的二抗購自上海BBI 生命科學(xué)有限公司；瞬時轉(zhuǎn)染的siRNA及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的shRNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、嘌呤霉素鹽酸鹽購自上海翊圣生物科技有限公司；UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒購自生工生物有限公司；Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Super MiX for qPCR、2×Hieff PCR Master Mix(With Dye) 、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus) 試劑盒均購自上海翊圣生物科技有限公司；其余試劑均為分析純.

1.3 儀器

imark型酶標(biāo)儀(伯樂，美國)；DMi8型倒置熒光顯微鏡(徠卡，德國)； Quant Studio 5型實(shí)時定量PCR儀(賽默飛世爾，美國)；Eppendrof 5424R型低溫高速離心機(jī)(艾本德，德國)；1658001型垂直電泳帶轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(伯樂，美國)； Tanon 5200型化學(xué)發(fā)光成像儀(天能，中國上海)； Thermo Scientific 3425型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾，美國).

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗所采用的人彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8為懸浮細(xì)胞，按照購買說明所述，細(xì)胞使用10%含牛胎血清1 640培養(yǎng)基，在37 ℃， 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).

1.4.2 青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖的抑制活性分析

收集對數(shù)增長期的SU-DHL-8細(xì)胞，離心，計數(shù)，接種于96孔板，并將已經(jīng)配制好的青蒿素儲備液(10 mol/L)分別稀釋到5個不同的濃度(100、20、4、0.8、0.16 μmol/L)，分別將不同濃度的藥物依次加入96孔板中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h之后，每孔加入5 mg / mL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，吸出板內(nèi)的細(xì)胞液，加入100 μL DMSO溶解甲瓚，用普通酶標(biāo)儀于570 nm處測定OD值，并計算抑制率.

1.4.3 qPCR測定基因的表達(dá)情況

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞收集離心、重懸計數(shù)，并將其接種于不同的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為5×106個/皿，分別分為實(shí)驗組和對照組，兩組同時做時間梯度(2、24 h)，實(shí)驗組加入青蒿素，終濃度為10 μmol/L，對照組加入相同體積的DMSO，按時間梯度收集細(xì)胞，提取RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過擴(kuò)增，qPCR等操作分析相關(guān)基因的表達(dá)情況.

1.4.4 Western blot檢測CHAC1蛋白的表達(dá)

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞收集計數(shù)，并接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為5×105個/孔，實(shí)驗組分別加入不同濃度的樣品處理24 h，對照組加入相同體積的DMSO,收集細(xì)胞加入裂解液冰上裂解40 min，10 000 g，4 ℃離心10 min，取上清測定并調(diào)節(jié)蛋白濃度，使蛋白濃度相等，再將蛋白加入上樣緩沖液95 ℃變性5 min，離心，取上清上樣，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，分離膠濕法轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉TBST溶液封閉2 h，4 ℃敷一抗過夜，洗膜30 min，10 min/次;二抗1 h，洗膜30 min，10 min/次，將顯影液覆蓋洗好的膜避光孵育5 min，除去顯影液，用保鮮膜把膜包好，放入化學(xué)發(fā)光儀中顯影.

1.4.5 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建

1) siRNA片段的設(shè)計 根據(jù)要求設(shè)計合成的沉默CHAC1基因和SiRNA共有3個，編號及序列如表1所示.

表1 siRNA的相關(guān)信息

2) siRNA轉(zhuǎn)染步驟 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞并接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為(2～5)×106個/孔，取1 μL/孔lipofectamine 2 000(使用前輕輕搖勻)，用200 μL Opti-MEM稀釋，輕輕混合后，室溫孵育5 min，取2 μL 熒光標(biāo)記的FAM siRNA或目標(biāo)siRNA用200 μL Opti-MEM稀釋，輕輕混合均勻，室溫孵育20 min，將混合好的轉(zhuǎn)染物加入6孔板內(nèi)，400 μL/孔，(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，取適量熒光標(biāo)記的FAM siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率.

1.4.6 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建

1)shRNA的相關(guān)信息 CHAC1的核苷酸序列為5′-GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGA ACGT-GACACGTTCGGAGAACTTTTTTG-3′；Control為慢病毒干擾空載體LV3(H1/GFP & Puro).

2) shRNA的轉(zhuǎn)染步驟 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，計數(shù)并接種于96孔板(方法參照MTT實(shí)驗)，用無菌EP管稀釋1×108TU/mL的病毒原液分別為1，10、100倍；并將其分別加入孔板中，每孔10 μL(病毒終濃度相當(dāng)于分別稀釋10、100、1 000倍)；37 ℃，5% CO2孵育8～12 h后觀察細(xì)胞形態(tài)(無明顯差異)，分別在感染24、48、72、96 h后觀察熒光表達(dá)情況，確定合適轉(zhuǎn)染濃度.將配置好的嘌呤霉素鹽酸鹽的儲備液(8 mg/mL)分別稀釋至0.5、1、2、4、8 μg/mL的工作液并加入96孔板中培養(yǎng)24 h，分別對每個質(zhì)量濃度梯度的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，確定嘌呤霉素鹽酸鹽的最小使用度量濃度(2 μg/mL)，對慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，每傳一代向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入嘌呤霉素鹽酸鹽，使每皿的終質(zhì)量濃度為2 μg/mL，這樣就得到了逐代富集的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，需要注意的是，實(shí)驗過程中的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株不需要再加入嘌呤霉素鹽酸鹽，以免影響實(shí)驗效果.

1.5 統(tǒng)計方法說明

文中數(shù)據(jù)平均值通過至少3次獨(dú)立實(shí)驗結(jié)果計算而得，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學(xué)比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學(xué)顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤的增殖抑制作用

MTT法測定細(xì)胞活性的結(jié)果如圖1a所示，青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8增殖有明顯的抑制效果，青蒿素的結(jié)構(gòu)如圖1b.分別取不同用藥濃度的細(xì)胞用熒光顯微鏡觀察明場下細(xì)胞的密度并拍照如圖1c，與不加藥組相比，細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制且具有濃度依賴性，和活性的測定結(jié)果一致.

2.2 青蒿素對CHAC1基因和蛋白的表達(dá)影響

采用qPCR的方法分析實(shí)驗組和對照組的CHAC1基因表達(dá)影響，結(jié)果如圖2a所示，與對照組相比實(shí)驗組中CHAC1基因的表達(dá)在2 h的時候無明顯區(qū)別，但在24 h的時候，實(shí)驗組中CHAC1基因的表達(dá)明顯上調(diào).采用Western Blot蛋白免疫印跡的方法分析青蒿素作用于彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8后CHAC1蛋白的表達(dá)情況如圖2b所示，在青蒿素刺激細(xì)胞24 h后，與對照組相比，實(shí)驗組中CHAC1蛋白的表達(dá)明顯提高.

qPCR基因表達(dá)值至少3次獨(dú)立實(shí)驗結(jié)果計算而得，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學(xué)比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學(xué)顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2.3 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建

siRNA感染細(xì)胞株之后轉(zhuǎn)染效率如圖3a所示，用熒光倒置顯微鏡分別在明場及熒光488 nm處拍攝，(熒光強(qiáng)度越強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率越高)3個siRNA的轉(zhuǎn)染效率均>70%，對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析如圖3b，與對照組相比(轉(zhuǎn)入FAM siRNA)，轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的siRNA后，CHAC1基因的表達(dá)明顯下調(diào)；Western Blot實(shí)驗測定CHAC1蛋白的表達(dá)情況如圖3c，CHAC1蛋白表達(dá)減少；采用MTT實(shí)驗測定青蒿素對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的增殖抑制結(jié)果如圖3d，與轉(zhuǎn)入FAM siRNA的細(xì)胞相比，青蒿素對轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的siRNA細(xì)胞的增值抑制作用下降.這表明青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8的增殖抑制作用和CHAC1基因的表達(dá)相關(guān).平均值通過至少3次獨(dú)立實(shí)驗結(jié)果計算而得，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學(xué)比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學(xué)顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

2.4 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建

shRNA感染細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率如圖4a，用熒光倒置顯微鏡分別在明場及熒光488 nm處拍攝，(熒光強(qiáng)度越強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率越高)Control組和shRNA：CHAC1組的轉(zhuǎn)染均效率 > 90%.對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析如圖4b，與Control組相比，轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的shRNA后，CHAC1基因的表達(dá)明顯下調(diào)；Western Blot實(shí)驗測定CHAC1蛋白的表達(dá)情況如圖4c，沉默CHAC1基因后CHAC1蛋白的表達(dá)減少；采用MTT實(shí)驗測定青蒿素對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的增殖抑制結(jié)果如圖4d，與Control組的細(xì)胞相比，青蒿素對轉(zhuǎn)入沉默CHAC1的shRNA細(xì)胞的增值抑制作用下降.這表明青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8的增殖抑制作用和CHAC1基因的表達(dá)相關(guān).平均值通過至少3次獨(dú)立實(shí)驗結(jié)果計算而得，誤差線用標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SE)表示，統(tǒng)計學(xué)比較采用雙尾t檢驗，統(tǒng)計學(xué)顯著性數(shù)據(jù)用星號表示，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001.

采用2種不同形式的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染后，siRNA及shRNA的轉(zhuǎn)染效率均>70%，視為有效轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別進(jìn)行基因表達(dá)分析及蛋白表達(dá)水平檢測，結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)染沉默CHAC1基因的RNA片段后，SU-DHL-8細(xì)胞內(nèi)CHAC1基因及蛋白的表達(dá)均下降， MTT實(shí)驗對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株進(jìn)行活性分析，結(jié)果表明選擇性沉默CHAC1基因后青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤SU-DHL-8細(xì)胞的增值抑制作用下降.

3 討論

MTT實(shí)驗結(jié)果中，青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8有明顯的增殖抑制效果，進(jìn)一步的基因及蛋白表達(dá)分析表明，在對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8的增殖抑制過程中，青蒿素上調(diào)了CHAC1基因及蛋白的表達(dá).這些結(jié)果說明CHAC1基因可能參與到青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤增值抑制的作用機(jī)理中.

接著，我們采用沉默CHAC1基因的siRNA對SU-DHL-8細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗，在驗證了轉(zhuǎn)染效率之后，對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與對照組相比，在沉默CHAC1基因之后，細(xì)胞內(nèi)的CHAC1基因表達(dá)下調(diào)；對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，與對照組相比，CHAC1基因沉默后，CHAC1蛋白的表達(dá)水平降低；這說明siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞后確實(shí)達(dá)到了沉默CHAC1基因的效果；我們同樣對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行活性分析，MTT實(shí)驗結(jié)果表明，在沉默CHAC1基因后，青蒿素對淋巴瘤細(xì)胞的增長抑制作用降低.這個結(jié)果進(jìn)一步驗證了之前的分析.

課題組接著設(shè)計了和siRNA瞬時轉(zhuǎn)染相同實(shí)驗的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗，采用攜帶穩(wěn)定沉默CHAC1基因的慢病毒感染SU-DHL-8細(xì)胞，基因和蛋白表達(dá)分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)染達(dá)到了預(yù)期的沉默效果，活性分析結(jié)果表明沉默掉CHAC1基因后，青蒿素對細(xì)胞株的增長抑制作用降低.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗結(jié)果和瞬時轉(zhuǎn)染的結(jié)果一致.這說明CHAC1基因在青蒿素對彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8增殖抑制中扮演著重要的角色.

通過建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的模型，對CHAC1基因在青蒿素引起的彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞SU-DHL-8的增殖抑制作用中的表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析，印證了之前實(shí)驗的結(jié)果，在以往的研究中，青蒿素在抑制腫瘤細(xì)胞增殖過程中CHAC1基因的作用未見報道，而課題組的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素在對DLBCL細(xì)胞的增殖抑制中上調(diào)了CHAC1基因的表達(dá)，且沉默CHAC1基因后，青蒿素對DLBCL細(xì)胞的增殖抑制作用減弱，說明CHAC1基因在青蒿素抗腫瘤作用機(jī)理中有一定的作用，我們的發(fā)現(xiàn)對進(jìn)一步研究CHAC1基因的作用及青蒿素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用機(jī)理提供了新的思路和方法，和瞬時轉(zhuǎn)染相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能長時間保存轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，有利于對作用機(jī)理的長時間研究.