菌糠炭與微生物協同吸附-降解石油烴類污染物

張博凡，徐文斐，王加華，熊 鑫，韓 卓，張秀霞，張 釗，劉會娥，顧瑩瑩

(1.中國石油大學(華東)化學工程學院，山東 青島 266580；2.上海康恒環境股份有限公司，上海 201700；3.勝利油田分公司技術檢測中心，山東 東營 257000)

隨著石油工業的發展，石油污染逐漸加劇[1]，有機污染物質在環境中殘留時間長，結構穩定、不易降解，對環境及人體造成嚴重威脅。由于微生物修復技術具有成本低、無二次污染及處理效果好等優點，近年來在有機污染修復中應用比較廣泛[2]。固定化微生物技術因其具有菌密度高，有利于屏蔽惡劣環境等優勢，受到越來越多的關注與應用[3]。

菌糠(Spent mushroom substrate，SMS)是食用菌種植業的殘余廢料，每生產1 kg食用菌約產生5 kg 菌糠[4]，每年大約有8000多萬t廢棄菌糠通過焚燒、填埋等傳統方式處理，不僅浪費土地資源，還會造成不同程度的環境污染。研究發現，菌糠中含有豐富的營養物質、大量真菌菌絲體以及酶類物質，其不僅可以作為微生物載體，又可以通過真菌-酶強化細菌降解有機污染物[5-7]，提高污染物去除效率。

生物炭是由生物質熱解所得的一種多孔且富含碳的固體產物，它具有較大的比表面積、豐富的表面官能團和發達的孔隙結構可以吸附重金屬和有機污染物[8]，其結構和組成的優勢在環境污染修復中具有巨大的潛在應用價值。生物炭的性質受制備溫度、原材料、保留時間等多種因素影響，其中熱解溫度對其性質影響較為顯著，不同溫度下制備的生物炭對有機污染物的吸附性能也存在較大差異[9-10]。

目前對于吸附法固定化微生物技術修復有機污染物的研究取得了一定的成效[11]，尋找優良的吸附載體是該技術的關鍵步驟，由菌糠限氧熱解制備所得的菌糠炭不僅能為微生物提供生存場所，提高吸附固定化效果[12]，解決微生物易脫落的問題，同時對石油烴有較強的吸附能力，增大微生物與石油烴接觸，進而提高降解效果，成為近幾年研究熱點。

筆者通過制備不同溫度下(250、350、450、550、650 ℃)的菌糠炭，分析菌糠及不同溫度菌糠炭的結構差異，探究其對微生物、石油烴的吸附效果，并將其與篩選得到的高效降解菌結合，尋找最佳吸附固定化載體用于吸附-降解石油烴，分析不同吸附及降解效果與結構性質之間的關聯性，進一步探究吸附-降解機制，同時為廢棄生物質菌糠的資源化利用尋找新途徑，以達到“以廢制廢”的雙重效果。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

石油選自勝利油田原油，其中四組分飽和分、芳香分、膠質、瀝青質質量分數分別為49.15%、22.38%、23.12%、5.35%。

實驗菌株Q1是以勝利油田污染土壤為菌源，以勝利原油為碳源，經16S rDNA生物分子學鑒定為Ochrobactrumsp.Q1，在原油質量濃度為 1000 mg/L 的無機鹽培養基中，蒼白桿菌Q1在7 d內對石油烴四組分降解率分別為30.87%、18.69%、4.57%、2.38%。

菌糠選自山東青島天農食用菌有限公司，將菌糠放置于冰箱保存，取部分洗凈后于75 ℃烘箱中干燥12 h，將其粉碎過篩密封保存。

1.2 菌糠炭的制備

將已烘干的菌糠(記為SMS)置于陶瓷坩堝中，壓實蓋子，包上鋁箔錫紙密封，放于管式爐中熱解炭化。設置升溫速率為10 ℃/min，制備溫度分別為250、350、450、550、650 ℃，保留時間為3 h，冷卻至室溫后，密封保存備用，樣品分別記為BC250、BC350、BC450、BC550、BC650。

1.3 菌糠及菌糠炭養分測定及表征

參照GB/T 12496.7—1999 《木質活性炭試驗方法-pH值的測定》測定pH值。采用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定有機質[13]；采用凱氏定氮法測定全氮[13]；采用NaHCO3-鉬銻抗比色法測定有效磷[13]；采用Boehm滴定法測定表面官能團含量[14]；采用酸堿滴定法測定表面零電荷點[15]。

采用元素分析儀測定C、H、N元素含量；采用傅里葉變換紅外光譜儀分析表面官能團；采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀測形狀及表面形態；采用ASAP2020M型物理分析儀測定比表面積、孔體積和孔徑大小。

1.4 菌糠及菌糠炭吸附-降解性能實驗

1.4.1 菌糠及菌糠炭對微生物的吸附實驗

蒼白桿菌Q1活化16 h后，此時菌液濃度為2.139×109CFU/mL，將其與菌糠和菌糠炭分別以20/1和10/1體積比混合，置于30 ℃、160 r/min的搖床中振蕩吸附，于 0.5、1、2、3、5、10、18、24和30 h進行取樣測定，將樣品在1000 r/min條件下離心分離10 min，棄去上清液，將離心所得沉淀真空冷凍干燥，即得到固定化微生物。采用稀釋平板計數法測定固定化微生物中吸附固定的生物量。

以吸附時間為橫坐標，吸附微生物量為縱坐標，繪制出吸附曲線，并確定最佳吸附微生物載體。

將制備所得的固定化菌劑樣品用Biosafer-10A型真空冷凍干燥機干燥，噴金后進行電鏡掃描。

1.4.2 菌糠及菌糠炭對石油烴四組分的吸附實驗

將滅菌后的菌糠及菌糠炭分別以1/100和 1/200(m/V，g/mL)比例投入質量濃度為1000 mg/L的原油培養基中，同時加入NaN3抑制微生物降解作用，置于30 ℃、160 r/min的搖床中振蕩，吸附24 h后在5000 r/min下離心分離10 min，將上清液轉移至錐形瓶中，并加入50 mL二氯甲烷進行震蕩，并在超聲波中萃取15 min，超聲波強度 100 W，超聲水浴溫度25 ℃，超聲結束后轉移至分液漏斗中，振搖，棄去水相，有機相用無水硫酸鈉過濾脫水，接收濾液于蒸發瓶中，置于干燥箱50 ℃下蒸干水分，提取的油樣經真空冷凍干燥后，采用NB/SH/T0509—2010《石油瀝青四組分測定法》對四組分分離，測定其各自吸附量。

1.4.3 菌糠及菌糠炭協同微生物對石油烴的吸附-降解實驗

將1.4.1節中吸附飽和后所得的固定化菌劑投入質量濃度為1000 mg/L的原油培養基中，置于30 ℃、160 r/min的搖床中振蕩培養，7 d后取樣，按1.4.2節中所述方法測定剩余石油烴四組分含量，進而計算出各組分降解率。

1.4.4 相關性分析

采用SPSS 22.0軟件分析菌糠炭對微生物、石油烴吸附效果及協同微生物對石油烴吸附-降解效果，與載體材料理化性質及結構特性間的相關性。

2 結果與討論

2.1 菌糠及菌糠炭的性質分析

不同溫度下熱解制備的菌糠炭(250～650 ℃)的基本性質如表1所示。由表1可以看出，隨著制備溫度升高，pH值增加，由6.50升至13.21，原材料呈弱酸性，而菌糠炭堿性不斷增強；養分中的有機碳質量分數由15.45 mg/g增至34.48 mg/g，全氮質量分數由21.12 mg/g降低為14.44 mg/g，有效磷含量呈先升高后降低趨勢；菌糠及菌糠炭的養分，可以為微生物提供充足的營養物質，保證其生長繁殖，提高菌密度；炭化溫度越高，堿性官能團含量增加，部分含氧酸性官能團受熱發生分解，導致其含量減少。表面零電荷點pHPZC作為表征酸堿性的參數之一，是指水溶液中固體表面凈電荷為零時的pH值。生物炭pHPZC與表面酸性官能團羧基含量存在密切相關性，酸性官能團在水中分解產生氫離子，pHPZC數值減少，且熱解溫度越高，含氧官能團含量較低，pHPZC由7.09增加到9.83，堿性增強，這與上述菌糠和菌糠炭pH值數據相吻合。菌糠炭中C元素質量分數從33.46%增加至38.94%，H、N元素含量減少，n(H)/n(C)可以用來表征其芳香性，隨著溫度的升高，n(H)/n(C)由1.59降低到0.20，這表明熱解過程中水分和脂肪族化合物流失，芳香性增強，碳化更為徹底，穩定性提高。同時，菌糠炭比表面積和孔體積呈現一定變化規律，在溫度區間250～550 ℃時，比表面積由 4.0804 m2/g 增加至109.2691 m2/g、孔體積由0.010968 cm3/g增加至0.102631 cm3/g；而BC650比BC550的比表面積和孔體積均有所減少，說明溫度升高，孔道被打開呈無序狀態，從而使比表面積增加，孔結構更為發達，但制備溫度較高時易造成孔結構塌陷，孔道堵塞，比表面積減少，孔體積也相應減少。

表1 菌糠和菌糠炭的基本理化性質Table 1 Physical and chemical properties of SMS and biochars

圖1為菌糠及菌糠炭的FTIR譜圖。由圖1可以看出，菌糠及不同溫度下的菌糠炭都含有豐富的官能團結構，隨著熱解溫度升高，官能團總含量減少，菌糠以及菌糠生物炭均在3447 cm-1處有吸收峰，此處是—OH伸縮振動，且隨著溫度升高，有機物分解脫去結合水，羥基峰逐漸減弱；2924 cm-1處，C—H伸縮振動峰逐漸消失，SMS和BC250較為明顯，而BC450、BC550、BC650幾乎缺失，這表明碳化過程中，烷基鏈不斷缺失，菌糠炭芳香性增高。在1000～1300 cm-1附近為芳環C—H的伸縮振動，在1635 cm-1附近出現芳烴骨架伸縮振動峰，且溫度越高，基團含量驟減，這可能是由于熱解過程中木質纖維素等大量分解，芳烴骨架發生斷裂所致；1435 cm-1為芳環 C—C 的伸縮振動，775和 876 cm-1附近吸收峰為芳環C—H的彎曲振動，其振動強度隨溫度升高變化較為明顯，表明溫度越高，菌糠炭的芳香性及穩定性越強，吸附有機物能力較好，這與上述元素分析結果相一致。

圖1 菌糠及菌糠炭的FT-IR譜圖Fig.1 FT-IR spectra of SMS and biochars

2.2 菌糠及菌糠炭對微生物的吸附性能

菌糠及菌糠炭對蒼白桿菌Q1的吸附曲線如圖2所示。由圖2可以看出，在初始階段，吸附較為迅速，吸附量上升明顯，這是由于初期載體材料吸附位點暴露明顯，微生物活性高，因此吸附速率快。在10 h附近，吸附變得較為緩慢，吸附位點大多數已被占據，傳質作用受到限制，吸附量不再增加，吸附基本接近平衡。其中菌糠炭BC550吸附平衡時間較短，吸附固定化微生物量較大，為1.582×1010CFU/g，即1 g固定化微生物的生物量相當于7.42 mL游離菌菌液的生物量。一方面是由于較高溫度下制備的菌糠炭吸附位點較多，與微生物結合作用力大于靜電斥力，載體材料表面堿性官能團含量增加，與細胞間疏水作用減弱，結合更為牢固；另一方面，BC550孔結構發達，比表面積大，表面粗糙更有利于微生物分泌的聚合物形成生物膜附著，使得載體和微生物之間形成共價鍵，從而形成特異性吸附，吸附迅速且效果穩定持久。而BC650因制備溫度過高，使得孔結構塌陷，比表面積減少，吸附量小于BC550。這也進一步說明微生物固定化效果受載體材料表面結構特性影響較大。隨著時間的延長，吸附量略微降低，吸附基本接近飽和，此時微生物活性下降，吸附位點被全部占據[16]，吸附不再進行。

圖2 菌槺及菌槺碳對菌株Q1的吸附固定曲線Fig.2 Adsorption curve of bacteria Q1 onto SMS and biochars

圖3為BC550對菌株Q1微觀結構固定化前后掃描電鏡照片。由圖3可以看出，附著在BC550表面的為桿狀菌，這與實驗前期對Q1分子生物學鑒定為桿狀菌結果相一致，因桿菌一般長為5～15 μm，寬為0.3～0.5 μm[17]，經測定BC550平均孔徑為8.8 nm，菌株難以進入到生物炭孔道內部，因此蒼白桿菌Q1吸附在菌糠炭表面。

圖3 生物炭樣品BC550及其固定化菌株Q1的SEM照片Fig.3 SEM photos of BC550 and its immobilized bacteria Q1(a)BC550;(b)BC550 immobilized bacteria Q1

2.3 菌糠及菌糠炭對石油烴四組分的吸附性能

菌糠及不同溫度下制備的菌糠炭對石油烴四組分的吸附效率如圖4所示。

圖4 菌糠及菌糠炭對石油烴四組分的吸附率Fig.4 Adsorption efficiency for different components of oil by SMS and biochars

由圖4可以看出，不同溫度下制備的菌糠炭對石油烴四組分吸附率呈現不同的變化趨勢。對于飽和分和芳香分，隨著溫度升高，吸附率先增加后減少，其中BC450吸附效率最高，分別為42.22%、30.98%。對于膠質、瀝青質，高溫菌糠炭吸附性能比低溫炭優異，但由于溫度過高，孔口堵塞，孔道發生扭曲，吸附位點減少，使得BC550對二者吸附率高于BC650，分別為36.33%、25.59%。總的來看，對總石油烴吸附率最高的為BC550。造成上述吸附性能差異的原因有多方面因素，是由多種吸附機制共同作用的結果：首先飽和分主要是一些烷烴類，為鏈狀結構，膠質、瀝青質主要是一些呈平面結構的環狀芳烴類；而制備所得菌糠炭具有層狀分布特性[18]，增強了后者填充菌糠炭孔隙的可能，一定范圍內，溫度升高，微孔體積和數量增加，污染物吸附進入空隙中會被阻攔無法出入，形成不可逆孔，吸附強勁有力，解吸作用較為困難。其次制備溫度升高，芳香性增強，π電子增多，而芳烴π電子供體比烷烴多，這就使得炭與環狀芳烴間形成 π-π 強電子交互作用，吸附作用穩定且不可逆。

2.4 菌糠及菌糠炭固定化微生物對石油烴四組分的吸附-降解性能

菌糠及不同溫度下制備的菌糠炭固定化微生物對石油烴四組分的降解率如圖5所示。

由圖5可以看出，不同載體材料固定化微生物對石油烴四組分降解效果存在一定差異，對于飽和分和芳香分，其結構相對簡單，容易被微生物降解，因此在四組分中降解率較高，其中BC550對二者降解效果最好，分別為62.04%、40.31%。對于膠質、瀝青質，大多數為環狀難降解芳烴類，SMS對其降解率最高，分別為17.26%、12.91%。盡管菌糠比表面積、孔體積較小，但由于菌糠呈現一定區域骨架結構[19]，有利于增加傳質效果；其次菌糠中存在大量真菌菌絲體，能夠分泌漆酶和錳過氧化物酶等，這些酶類能夠黏附在載體表面及孔隙中協同降解菌構成真菌-酶-細菌體系，強化降解芳烴類物質。高溫炭固定化微生物對石油烴的降解作用要強于低溫炭，一方面是由于高溫炭對污染物吸附性能好，能夠增加微生物與污染物之間的接觸機會，提高其生物可利用性，進而提高降解率，但由于BC650固定化微生物量低，吸附污染物能力較差，所以降解效率低于BC550；另一方面，菌糠低溫下熱解尚未完全，孔結構不發達，比表面積較小，固定化微生物的能力相對較差，因此降解效率較低。

圖5 菌糠及菌糠炭固定化微生物對石油烴四組分的降解率Fig.5 Degradation rate of oil by SMS and biochars immobilized bacteria

石油烴降解效果不僅受載體材料結構性質影響，還與其理化性質、養分含量等因素有關，隨著溫度升高，所制備的載體材料pH值、有機碳含量不斷增加，微生物在pH值為7～7.5左右[20]，充足營養物質時降解效果最佳，盡管BC550的pH值較高，但隨著降解反應不斷進行，其能夠中和微生物降解石油烴所產生的有機酸等中間產物，使環境pH值接近中性；此外微生物活動受養分含量影響較大，而高溫菌糠炭有機質含量較高，N、P含量適宜，能夠為微生物的代謝活動提供充足養分，從而降解效果較佳。

此外，以二氯甲烷為溶劑對吸附降解后的固定化材料BC550離心、超聲萃取進行解吸，并分析測定此時石油烴含量，數據結果表明，脫附后石油烴含量僅為總吸附量的10.47%，即大部分石油烴通過微生物降解作用去除；吸附降解實驗表明，固定化載體材料BC550兼具吸附和降解能力，其中降解作用在去除污染物方面占據主導地位，較好的吸附能力在降解污染物過程中起到了促進作用，進而大大提高降解效率。

2.5 菌糠炭協同微生物對石油烴吸附及降解效果與其理化性質及結構特性之間的相關性

由上述結果分析可得，菌糠及菌糠炭協同微生物對石油烴降解效果與載體材料性質存在一定的相關性，采用SPSS 22.0軟件對菌糠及菌糠炭協同微生物吸附-降解石油烴與材料的pH值、有機碳、全氮、速效磷、比表面積、孔體積、n(H)/n(C)、酸性官能團含量、表面零電荷點參數間相關性進行分析，實驗結果如表2所示。

表2 菌糠及菌糠炭吸附-降解性能與其基本性質的相關性分析Table 2 Correlation of adsorption and degradation performance of SMS and biochars with its properties

1)Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed);2)Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).Thepvalue is the probability,which reflects the likelihood of an event happening.

由表2可以看出，菌糠及菌糠炭對微生物吸附與pH值、有機碳、BET比表面積、孔體積、表面酸性官能團摩爾濃度和表面零電荷相關性較為顯著，分別為0.862、0.929、0.865、0.933、-0.892、0.929，這說明其對微生物的吸附不僅與載體材料結構和性質關系密切，還受一定的環境因素和營養物質的影響[21-22]。而對石油烴的吸附與比表面積、孔體積、n(H)/n(C)、酸性官能團摩爾濃度相關性顯著，分別為0.878、0.968、-0.903、-0.843。與微生物吸附作用不同的是，石油烴吸附主要與吸附材料孔特性、n(H)/n(C)、表面官能團摩爾濃度密切相關，而受環境條件的限制相對較弱，其中pH值對其影響相對較弱，相關性系數為0.503，說明材料本身性質在吸附石油烴中占據主導位置。而菌糠及菌糠炭協同微生物對石油烴吸附-降解與多種因素相關性顯著，該過程不僅涉及石油烴吸附作用，還包括微生物降解作用，其中顯著性最強的為有機碳、孔體積和n(H)/n(C)，分別為0.902、0.927、-0.911，吸附-降解過程不僅要維持足夠營養物質供微生物代謝繁殖，還要提供一定的生存場所。其次孔體積較大，孔結構發達，對石油烴吸附作用主要為孔隙填充，且菌糠炭溫度較高時，芳香性增強，π-π鍵結合力牢固。因此進一步說明一定溫度范圍內，菌糠炭制備溫度越高，對微生物、石油烴吸附越好，協同微生物對石油降解率也越高。

綜合上述相關性分析，菌糠炭制備溫度較高時，pH值、有機碳增加，微生物生長代謝所需營養物質充裕，其次芳香性、孔體積增大，穩定性增強，能為微生物提供生存場所；同時對石油烴吸附能力增強，微生物攝取石油烴能力增加，加速對石油烴的降解，其中BC550協同微生物對石油烴吸附-降解效果最好。

3 結 論

(1)隨著炭化溫度升高，菌糠炭理化性質和養分呈現一定的變化規律，其中堿性及芳香性增強，菌糠炭表面官能團含量減少，有機碳含量增加，比表面積、孔結構比低溫炭發育更加完全。

(2)由吸附及降解性能實驗可得，高溫炭比低溫炭的吸附及降解性能好，其中550 ℃菌糠炭對微生物吸附量最大，為1.582×1010CFU/g，BC550協同微生物對石油烴四組分總體降解率也均高于菌糠及其他溫度下制備的菌糠炭。

(3)菌糠及菌糠炭對微生物、石油烴吸附及協同微生物吸附-降解石油烴的效果與載體材料有機碳、孔體積及芳香性相關性顯著，因此制備溫度升高，既能提高其對微生物和石油烴的吸附性能，又能夠強化微生物降解石油烴。