基于1H-NMR的復(fù)合應(yīng)激勃起功能障礙大鼠模型血清代謝組學(xué)及藥物干預(yù)的研究*

艾孜孜·熱合曼 劉鳳霞 斯依提·阿木提 劉文娟 阿地力江·伊明**

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室（烏魯木齊，830011）2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室（烏魯木齊，830011）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指持續(xù)或反復(fù)不能達(dá)到或維持足夠的陰莖勃起完成滿(mǎn)意的性生活，40～70歲之間的男性中，約52%患有不同程度的ED[1]，而我國(guó)男性ED的總患病率為26.1%，40歲以上男性的患病率為40.2%[2]。據(jù)WHO估計(jì)到2025年ED患者將達(dá)到3.2億，并且ED的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[3]。目前ED主要的治療方法，包括5型磷酸二酯酶抑制劑、海綿體內(nèi)藥物注射和真空裝置等[4]，但整體效果欠佳[5]，因此ED確切的發(fā)病機(jī)制和更有效的治療方案亟待解決。ED作為男性常見(jiàn)性功能障礙疾病，他不僅以心血管疾病、糖尿病、高脂血癥等重大疾病的伴發(fā)性疾病出現(xiàn)，同時(shí)也可以以ED這一獨(dú)立疾病形式出現(xiàn)。目前針對(duì)前者研究較為深入，但是從環(huán)境因素出發(fā)，研究環(huán)境溫度改變、環(huán)境植物雌激素對(duì)勃起功能的影響尚有不足，有待深入開(kāi)展。故在前期工作中，我們通過(guò)模擬冷環(huán)境與雌激素樣飲食的復(fù)合刺激條件建立了復(fù)合應(yīng)激大鼠模型，對(duì)其性功能改變與勃起功能損傷進(jìn)行了初步的研究，并成功篩選出了ED大鼠模型[6,7]。本研究，則在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1HNMR）技術(shù)檢測(cè)了復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型血清代謝組變化和伊木薩克片的影響，探討ED可能的機(jī)制與伊木薩克片的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、資料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取正常雄性Sprag-Dawley（SD）大鼠150只，SPF級(jí)，6 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，性成熟雌性大鼠 20 只，2月齡，用于阿樸嗎啡（apomorphine，APO）陰莖勃起實(shí)驗(yàn)和交配實(shí)驗(yàn)，均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性常規(guī)飼養(yǎng)1周，室溫（20±2）℃，濕度40%～60%，自由飲水進(jìn)食。

（二）主要實(shí)驗(yàn)儀器

600 MHz核磁共振波譜儀 （美國(guó)Varian公司），－80℃超低溫冰箱（中國(guó)海爾公司），-20℃低溫冰箱（中國(guó)海爾公司），Millipore水純化系統(tǒng) （美國(guó) Millipore公司），低溫臺(tái)式超速離心機(jī) （德國(guó)Eppendorf公司），BSA224S-CW型電子分析天平 （北京賽多利斯天平有限公司）。

（三）主要試劑和藥材

阿樸嗎啡 （批號(hào)：A4393-250MG，美國(guó)Sigma公司）；黃體酮（批號(hào)：120804，浙江仙琚制藥股份有限公司，）；雌二醇（批號(hào)B130613，寧波市三生藥業(yè)有限公司）；伊木薩克片（批號(hào)：20130501，規(guī)格：6 片×1 板 /盒，新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司）；重水 （批號(hào)：20170605，美國(guó) Cambridge isotop laboratories公司）；WG-1000-7型核磁管 （規(guī)格：5mm×177.8mm，美國(guó)Wilmadlabglass公司）；4，4-二甲基 -4-硅戊烷 -1-磺酸（DSS）、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、戊巴比妥納、酒精、氯化鈉、甲醛、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭ㄙ?gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

二、方法

（一）復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型的制備、分組及伊木薩克干預(yù)

150只正常雄性大鼠中，隨機(jī)抽取30只為正常對(duì)照組（N組），余120只為造模組，按照文獻(xiàn)[5,6]方法制備環(huán)境雌激素樣飼料、發(fā)情雌鼠和復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型，篩選ED大鼠模型后，隨機(jī)分為復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型組 （ED組，30只）和伊木薩克干預(yù)組 （Y組，30只）。Y組大鼠予以伊木薩克片每日灌胃1次（250mg/kg體質(zhì)量），其余2組使用等劑量蒸餾水灌胃，干預(yù)2周。定期檢測(cè)APO勃起功能和交配能力。

（二）血清樣本采集

藥物干預(yù)結(jié)束后，將所有大鼠稱(chēng)量，并用1%戊巴比妥鈉腹腔注射 （40 mg/kg）麻醉。腹主動(dòng)脈抽血20 mL，室溫靜置 2 h，3000×g離心10 min，分離血清，置-80℃冰箱保存。

（三）血清樣品預(yù)處理

N組、ED組和Y組大鼠血清樣品從低溫冰箱中取出并在室溫中解凍，每份取700μL，加入3KDa超濾管內(nèi)，12000×g離心15 min，取上清液450μL加到5 mm的核磁管內(nèi)，再加重水配制的DSS緩沖溶液50μL（濃度為5.17 mmol/L)、混勻。

（四）大鼠血清1H-NMR測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

將N組、ED組和Y組大鼠血清核磁管置于600 MHz核磁共振波譜儀，進(jìn)行1H-NMR檢測(cè)。預(yù)飽和方式抑制水峰，脈沖序列為NOESYPR1D（RD-90-t1-90-tm-90-Acq）。測(cè)試溫度25℃，飽和時(shí)間為2 s，單次掃描時(shí)間為1.636 s，譜寬10000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64 k，掃描次數(shù)為128次。使用MestRenova分析軟件 （Mestrelab Research，Santiagode Compostella，西班牙）將核磁信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。以重水化學(xué)位移0.00 ppm單峰質(zhì)子信號(hào)作為化學(xué)位移參考峰定標(biāo)調(diào)整基線(xiàn)，得到一維氫譜圖。將1H-NMR圖譜在化學(xué)位移 δ9.0～0.5 ppm范圍內(nèi)以δ0.003 ppm積分區(qū)間進(jìn)行分段積分，除去δ5.20～4.75 ppm之間的水峰積分值。導(dǎo)入SIMCA-P＋11統(tǒng)計(jì)軟件（瑞典Umetries公司）進(jìn)行偏最小二乘判別式法分析（partial least squares diseriminant analysis，PLS-DA）篩選3組之間的差異性代謝物；進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）得出每2組之間的差異性代謝物。參數(shù)R2X、R2Y表示OPLS-DA模型的擬合情況，Q2表示模型的可預(yù)測(cè)度，他們的大小直接反應(yīng)模型的可靠程度，其值越接近1，代表模型擬合度越好，Q2＞0.4，則模型可靠。代謝物含量變化情況采用OPLS-DA分析中的變量相關(guān)系數(shù)r判斷，r為負(fù)值，說(shuō)明代謝物在實(shí)驗(yàn)組血清內(nèi)的含量高于對(duì)照組，r為正值，表示血清代謝物在實(shí)驗(yàn)組的含量低于對(duì)照組，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠1H-NMR血清代謝物圖譜指認(rèn)

采用MestRenova分析軟件對(duì)N組、ED組和Y組大鼠血清1HNMR圖譜中主要代謝物成分信號(hào)進(jìn)行了歸屬，指認(rèn)出的主要代謝物成分有21個(gè)（圖1），其化學(xué)移位、譜峰歸屬等詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

二、大鼠血清代謝物OPLS-DA模型擬合度分析

將1H-NMR圖譜以O(shè)PLS-DA和PLS-DA方法進(jìn)行模式識(shí)別分析，可得到3組大鼠血清代謝物1H-NMR圖譜的二維散點(diǎn)圖和三維空間分布圖，圖中每一個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)變量。3組大鼠血清代謝物在分布圖中分別落在不同區(qū)域，說(shuō)明這些分散點(diǎn)中所包含的信息必定存在不同程度的差異。3組大鼠血清代謝物分布圖（圖2），R2X、R2Y 和 Q2分別為 0.627、0.482、0.41。 N 組和 ED 組大鼠血清代謝物分布圖，R2X=0.45、R2Y=0.652、Q2=0.596（圖3）。Y組和ED組大鼠血清代謝物分布圖，R2X=0.524、R2Y=0.609、Q2=0.485（圖 4）。 結(jié)果說(shuō)明模型擬合度好，可靠程度高。

圖2 三組大鼠血清代謝物PLS-DA 分析

圖3 N組和ED組大鼠血清代謝物OPLS-DA分析

圖4 ED組和Y組大鼠血清代謝物OPLS-DA分析

三、各組大鼠血清差異性代謝物分析

與N組比較，ED組大鼠血清中VLDL、亮氨酸、膽堿、谷氨酰胺、丙酮、纈氨酸、γ-氨基丁酸、丙酮酸、谷氨酸、檸檬酸、肌酸、牛磺酸、蛋氨酸、天冬氨酸表達(dá)量降低；乳酸、丙氨酸、乙酰乙酸、氧化三甲基胺、β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖表達(dá)量升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ED組比較，Y組大鼠血清中乳酸、丙氨酸、氧化三甲基胺，β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖等表達(dá)量顯著降低；VLDL和膽堿表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其化學(xué)移位、譜峰歸屬等詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清差異性代謝物

討 論

應(yīng)激是機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)，又稱(chēng)為應(yīng)激反應(yīng)，它與糖尿病、高血壓、高脂血癥和肥胖癥等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)各種不同應(yīng)激可誘導(dǎo)體內(nèi)代謝水平發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致ED[9,10]。本團(tuán)隊(duì)前期研究采用環(huán)境雌激素樣飲食聯(lián)合冷刺激的干預(yù)方法成功建立了復(fù)合性應(yīng)激ED大鼠模型，伊木薩克可顯著改善ED大鼠的勃起功能[6]。本研究通過(guò)1HNMR檢測(cè)此ED大鼠模型血清代謝組的變化，探討其發(fā)病機(jī)制，并觀察伊木薩克干預(yù)后對(duì)代謝組的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)亮氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、纈氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和檸檬酸含量發(fā)生顯著改變。亮氨酸和丙氨酸與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)，能減輕大鼠機(jī)體的消耗，改善缺氧狀態(tài)；亮氨酸含量異常還可引發(fā)血管氧化應(yīng)激，加重動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[11,12]。谷氨酰胺是體內(nèi)重要抗氧化劑牛磺酸的前體，維持組織中谷胱甘肽的儲(chǔ)備、保護(hù)細(xì)胞、組織和器官免受自由基損傷，減輕應(yīng)激反應(yīng)，提高機(jī)體抗氧化能力[13]，參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[14,15]。纈氨酸可抑制腫瘤壞死因子、血管黏附因子-1、超氧化因子-2和內(nèi)皮型一氧化氮合酶等誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂[16,17]；其衍生物L(fēng)-谷氨酸-纈氨酸抑制炎細(xì)胞因子和白介素-1、6、8的表達(dá)，并通過(guò)抑制上皮細(xì)胞中腫瘤壞死因子-α信號(hào)傳導(dǎo)通路減輕炎癥[18]，而炎癥和內(nèi)皮功能紊亂也是ED的重要誘因[19,20]。谷氨酸是一種興奮性氨基酸，在炎癥反應(yīng)中有重要作用。當(dāng)組織損傷時(shí)，影響到谷氨酸代謝，激活一系列興奮性氨基酸受體，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致炎癥[21,22]；谷氨酸還可誘導(dǎo)神經(jīng)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y、白介素-1β、一氧化氮和活性氧等引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和血管內(nèi)皮功能紊亂等[23,24]；而炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷是ED常見(jiàn)的誘因[25,26]。γ-氨基丁酸可以通過(guò)拮抗谷氨酸的興奮性毒性，減輕細(xì)胞損傷和凋亡[27]，還能減少耗氧量，而機(jī)體的缺氧狀態(tài)與ED有著密切的關(guān)系[12,28]。蛋氨酸是琥珀酰輔酶A、同型半胱氨酸、半胱氨酸、肌酸和肉堿的前體，也是人體內(nèi)最容易被氧化的必需氨基酸之一。蛋氨酸缺乏可導(dǎo)致心臟血管病變、睪丸病變等；還可通過(guò)調(diào)節(jié)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化指標(biāo)抑制氧化應(yīng)激、抑制促炎細(xì)胞因子和核因子-κB活化來(lái)減少炎癥[24,29]。檸檬酸、谷氨酸和谷氨酰胺都是三羧酸循環(huán)的中間代謝物，參與炎癥代謝通路，與動(dòng)脈粥樣硬化有密切的相關(guān)性[30,31]。檸檬酸還具有降低內(nèi)毒素引起的氧化應(yīng)激的作用[14,32]。天冬氨酸含量變化與細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)、分化炎癥反應(yīng)相關(guān)[33,34]。在細(xì)胞發(fā)生骨架破壞、缺氧或ATP耗竭時(shí)，引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[35]，參與高血壓、心肌細(xì)胞凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[12,36]。結(jié)果提示，ED組大鼠血清中亮氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、纈氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和檸檬酸含量改變可能是機(jī)體物質(zhì)代謝紊亂的結(jié)果，通過(guò)參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙和血管性病變，進(jìn)而導(dǎo)致ED發(fā)生發(fā)展。

β-葡萄糖、β-呋喃糖、乳酸、胍基乙酸、肌酸均參與機(jī)體能量代謝和物質(zhì)代謝。葡萄糖可無(wú)氧酵解生成乳酸并產(chǎn)生少量的三磷酸腺苷供給機(jī)體能量[37]。葡萄糖含量異常可造成線(xiàn)粒體功能紊亂，影響機(jī)體正常物質(zhì)和能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[38]；血糖濃度增高還可以抑制血管舒張、導(dǎo)致血管壁鈣化和功能障礙，而這些變化是ED的重要誘因[39,40]。呋喃糖含量增多，導(dǎo)致活性氧物質(zhì)的產(chǎn)量增加，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和凋亡[41]。呋喃糖還可通過(guò)毒性作用，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的增多，參與炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能紊亂[42,43]，而炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能紊亂為ED的重要誘因[19,20]。乳酸能減輕機(jī)體的消耗，改善缺氧狀態(tài)[11,12]。缺氧可使海綿體平滑肌細(xì)胞收縮表型減少和海綿體纖顫等海綿體微結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而引起ED[44]。乳酸還可影響血管的收縮、舒張，而陰莖血管的正常收縮、舒張是陰莖正常勃起的關(guān)鍵[45,46]。胍基乙酸在酶的催化作用下能夠合成肌酸，肌酸被認(rèn)為是一種能量緩沖劑[47]，能影響血漿二氧化碳含量，參與高碳酸血癥，與陰莖海綿體組織損傷有關(guān)，肌酸還參與細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，這些功能都與ED密切相關(guān)[48,49]。胍基乙酸還可生成超氧陰離子（氧自由基），產(chǎn)生活性氧，而超氧陰離子等氧化應(yīng)激因子在ED中發(fā)揮著重要的作用[47,50]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合應(yīng)激ED大鼠血清中β-葡萄糖、β-呋喃糖、乳酸、胍基乙酸、肌酸含量顯著變化，此變化涉及的能量和物質(zhì)代謝紊亂可能通過(guò)誘導(dǎo)炎癥、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起內(nèi)皮功能障礙、血管舒張功能降低、海綿體微結(jié)構(gòu)改變等導(dǎo)致ED。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與血脂的運(yùn)輸和代謝密切相關(guān)的極低密度脂蛋白（VLDL）、丙酮、乙酰乙酸、丙酮酸、氧化三甲基銨（TMAO）和膽堿在復(fù)合應(yīng)激ED大鼠血清中含量顯著改變。VLDL堆積引起脂代謝紊亂可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、斑塊形成和血管內(nèi)皮功能障礙等[51,52]。而且VLDL與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)[19,20]。丙酮和乙酰乙酸均為酮體的組成部分。脂肪利用增加時(shí)，血中乙酰乙酸和丙酮等酮體濃度就會(huì)升高[53]，能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，其中乙酰乙酸影響VLDL的含量，而氧化應(yīng)激和VLDL代謝紊亂都能引起陰莖血管病變，進(jìn)而參與ED的發(fā)生發(fā)展[25,26]。丙酮酸在糖、脂肪和氨基酸間作為樞紐互相轉(zhuǎn)化，通過(guò)阻止超氧化物的形成防止氧自由基的產(chǎn)生，還可以與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成二氧化碳和水清除氧自由基，因此具有防止氧化損傷的作用[14,54]；丙酮酸還以丙酮酸鹽的形式抑制腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等炎癥因子的釋放，穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，而氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能紊亂已證實(shí)是ED發(fā)病的重要機(jī)制[55,56]。TMAO是由富含膽堿、磷脂酰膽堿和左旋肉堿的食物經(jīng)腸道微生物轉(zhuǎn)化生成三甲胺，在肝酶和黃素單加氧酶的作用下生成，參與氧化反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)，增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[57,58]。膽堿是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要成分，膽堿抗炎通路興奮后可抑制促炎因子的產(chǎn)生和釋放[59,60]。本研究結(jié)果提示VLDL、丙酮、乙酰乙酸、丙酮酸、TMAO和膽堿含量顯著改變，可能與能量和脂代謝紊亂通過(guò)誘導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致ED發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究采用1H-NMR檢測(cè)復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型血清代謝組變化，并觀察伊木薩克片的干預(yù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)21種代謝物在復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型血清中發(fā)生顯著變化，其中14種代謝物含量下降，7種代謝物含量增高；經(jīng)過(guò)伊木薩克片干預(yù)后，6種代謝物含量降低（乳酸、丙氨酸、氧化三甲基銨，β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖），2種代謝物（VLDL和膽堿）含量增高。此結(jié)果提示，復(fù)合應(yīng)激ED大鼠模型出現(xiàn)能量和三大物質(zhì)代謝紊亂，而伊木薩克片干預(yù)后可能通過(guò)改善機(jī)體代謝紊亂，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)引起的內(nèi)皮功能障礙和血管病變等機(jī)制促進(jìn)ED的恢復(fù)，但其具體的機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。