銀杏葉提取物抑制腎間質纖維化作用研究

溫 泉，荘健春，張 紅，張永凱

(吉林大學第一醫院，吉林 長春130021)

腎間質纖維化是幾乎所有腎臟疾病進展到終末期腎功能衰竭的共同途徑和主要病理基礎，是各種慢性腎病的共同轉歸。腎間質纖維化程度與腎功能受損程度高度相關，有效抑制和/或延緩腎間質纖維化進程，對腎臟功能的保護和延緩各種慢性腎病進展起重要作用，直接關系到慢性腎臟病患者的預后及轉歸。轉化生長因子-β(TGF-β)是最重要的腎間質纖維化相關的生長因子，多種原因引起的腎纖維化均可見其高表達，且其表達量也與腎間質纖維化程度高度相關。結締組織生長因子(CTGF)是TGF-β的下游因子，是由TGF-β激活后的早期即刻表達因子，與TGF-β相比，CTGF促組織器官纖維化效應特異性更高，抑制TGF-β/CTGF通路對多種器官纖維化的防治可能具有重要意義。由于中醫藥可通過多種機制發揮其保護腎功能、抑制或延緩腎間質纖維化進程等作用，在腎間質纖維化的治療中顯示了特有的優勢。有研究顯示，銀杏葉提取物(GBE)可抑制體外培養的腎間質成纖維細胞糖基化終末產物誘導的TGF-β1和CTGF mRNA過表達[1]。唐錦輝等[2]用GBE預防性治療大鼠實驗性腎小球硬化，發現GBE可以明顯減輕殘腎系膜區ECM積聚，降低腎小球硬化指數，明顯減少腎臟組織中輕脯氨酸含量，并明顯減輕腎小管間質細胞的增殖。本研究擬以單側輸尿管結扎法(UUO)復制大鼠腎間質纖維化模型，同時用GBE進行干預，探討GBE防治腎間質纖維化效果及其機制，為中藥治療腎間質纖維化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

銀杏葉片(批號:20151209)購自貴州信邦制藥股份有限公司；鹽酸貝那普利片(批號:15083)購自北京諾華制藥有限公司；羥脯氨酸含量測定試劑盒(A030)購自南京建成生物工程研究所；免疫組化染色試劑盒(PV-6000)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9017)多克隆抗體為北京中杉金橋生物工程公司產品；兔抗大鼠TGF-β1(A2124)和CTGF(A11943)抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；TRIzol、二步法逆轉錄PCR試劑盒(AQ201)購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 造模及分組

Wistar大鼠，雄性，體重180-200 g，購自遼寧長生生物技術有限公司(許可證號：SCXK(Liao)2015-0001)，于吉林大學醫學實驗動物中心飼養。所有實驗得到了動物管理機構的批準，且經吉林大學藥學院實驗動物倫理委員會同意。

大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為假手術組、模型組(UUO組)、銀杏葉治療組及貝那普利治療組，每組6只大鼠。除假手術組外，其余各組大鼠經乙醚吸入麻醉后，無菌條件下行腹正中偏左縱切口進入腹腔，游離左側輸尿管，在靠近腎門處及輸尿管下段分別結扎，并從中間剪斷輸尿管，逐層縫合腹壁及皮膚。假手術組只單純分離但不結扎和剪斷輸尿管即關閉腹腔。

1.3 給藥方法

自造模后第2天起各組動物開始給藥。銀杏葉治療組以150 mg/kg體重銀杏葉注射液腹腔注射，貝那普利治療組以15 mg/kg體重鹽酸貝那普利片混懸液灌胃，UUO組和Sham組給予等體積生理鹽水灌胃，每日一次。給藥2 w后，各組大鼠乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死，迅速取左側腎臟，上1/3于-20℃、下極1/3于-80℃貯存，中段1/3固定于10%中性甲醛緩沖溶液。

1.4 羥脯氨酸含量測定

取100 mg大鼠腎臟組織，按照羥脯氨酸含量測定試劑盒說明書以堿水解法進行羥脯氨酸含量測定。大鼠腎組織羥脯氨酸含量以μg/mg組織濕重計。

1.5 免疫組化檢測

用免疫組化法檢測各組大鼠心肌組織糜酶表達量。主要操作步驟：石蠟包埋腎組織切片經二甲苯脫蠟、水化后，置于pH6.0枸椽酸緩沖液中以微波加熱法進行抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶后，加適量一抗(抗TGF-β1和CTGF抗體稀釋比例為1∶200和1∶300)4℃孵育過夜，次日以適量酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育20 min后用適量新鮮配制的DAB顯色液顯色，蘇木素復染后脫水、透明、返藍，用ImageJ1.52分析染色陽性信號表達強度(IOD)。

1.6 實時定量RT-PCR檢測

采用相對定量實時定量RT-qPCR法檢測各組大鼠腎臟組織TGF-β1和CTGF mRNA表達。主要操作如下：按TRIzol說明書提取各組大鼠腎臟組織進行總RNA提取。按二步法逆轉錄PCR試劑盒說明書進行逆轉錄和PCR反應，以GAPDH作為內參。逆轉錄體系總體積為20 μl，含總RNA 1 μg，5XTransScript○RAll-in-one SuperMix for qPCR 4 μl，gDNA Remover 1 μl，經45℃孵育15 min，85℃孵育5 s以滅活逆轉錄酶和gDNA Remover。PCR體系總體積為20 μl，含mRNA模板 1 μl，上、下游引物各0.2 μl，2XTransStart○RTip Green qPCR SuperMix for qPCR 10 μl，94℃ 30 s預熱后，經94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃共40個循環。TGF-β1引物序列上游：5′-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3′，下游：5′-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAA-3′；CTGF引物序列上游：5′-CTAAGACCTGTGGAATGGGC-3′，下游：5′-CTCAAAGATGTCATTGCCCCC-3′；內參GAPDH引物序列上游：5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′，下游：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′。以2-ΔΔCT表示糜酶mRNA的相對表達量，ΔΔCT=(CTchymase-CTGAPDH)experiment-(CTchymase-CTGAPDH)control[3]。

1.7 數據分析

2 結果

2.1 各組大鼠腎纖維化程度比較

實驗結束后，各組大鼠狀態良好，對照組大鼠雙側腎臟對稱，體積及重量均無明顯改變，其余各組大鼠左側腎臟體積明顯增大，腎盂內大量尿液潴留，腎皮質變薄。羥脯氨酸含量測定結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腎組織羥脯氨酸含量均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)，銀杏葉治療組及貝那普利治療組大鼠腎組織羥脯氨酸含量比較，差異無顯著性，但均明顯低于模型組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腎組織羥脯氨酸含量表達比較

與假手術組比較，*P<0.05，與模型組比較，ΔP<0.05。

2.2 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF表達比較

免疫組化結果發現，正常大鼠腎間質即有少量TGF-β1和CTGF表達，圖像分析結果顯示，模型組大鼠左側腎間質TGF-β1和CTGF表達量均明顯升高，與假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而二者在銀杏葉治療組及貝那普利治療組大鼠腎間質表達量差異無顯著性，但均明顯低于模型組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2和表2。

A.假手術組；B.模型組；C.銀杏葉治療組；D.貝那普利治療組

A.假手術組；B.模型組；C.銀杏葉治療組；D.貝那普利治療組

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF免疫組化結果比較

與假手術組比較，*P<0.05，與模型組比較，ΔP<0.05。

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF mRNA表達比較

與假手術組大鼠比較，模型組大鼠左側腎組織TGF-β1和CTGF mRNA表達量均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而二者在銀杏葉治療組及貝那普利治療組大鼠腎組織表達量差異不顯著，且均明顯低于模型組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

3 討論

銀杏(Ginkgo biloba L.)為銀杏科、銀杏屬落葉喬木，其葉和果有重要藥用價值。大量研究顯示，GBE具有擴血管、降血脂、抗凝血、清除自由基、及抗炎、鎮痛和抗腫瘤等作用，已廣泛應用于心、腦血管疾病的預防和治療。趙艷玲等[4]發現，GBE可明顯抑制馬兜鈴酸腎病大鼠血尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平，并抑制腎組織中TGF-β1和CTGF的表達，表明GBE對馬兜鈴酸致腎纖維化有一定防治作用。劉曉剛等[4]研究顯示，GBE可減少腎病綜合征大鼠尿蛋白量，并降低其血脂水平。李相軍等[6]研究發現，給UUO大鼠口服GBE 2周后，GBE組大鼠NAG酶活性、尿肌醉、血尿素氮及血肌醉較UUO組均顯著降低，24 h尿蛋白排出量亦明顯下降，說明GBE對腎臟功能具有保護作用。本研究發現，GBE可明顯抑制UUO引起的大鼠腎間質羥脯氨酸含量，表明GBE可抑制或延緩腎間質纖維化進程。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF免疫組化結果比較

與假手術組比較，*P<0.05，與模型組比較，ΔP<0.05。

TGF-β是一種強效的致纖維化因子，在腎間質纖維化進程中多個環節中均起重要作用。CTGF作為TGF-β下游因子，具有更明顯的促進腎臟間質細胞增殖和細胞外基質的合成與分泌作用。有研究表明，UUO大鼠術后第1天即有腎組織TGF-β1 mRNA表達升高，而CTGF mRNA及蛋白表達量于UUO術后第3天開始升高直至實驗結束(14 d)，與腎間質纖維化程度呈正相關，表明CTGF高表達是腎間質細胞外基質產生的重要驅動因素之一[7]。因此，CTGF與TGF-β相互促進，形成正反饋，并通過TGF-β/CTGF/ECM通路參與腎間質纖維的形成和發展。本研究用免疫組化法及實時定量RT-PCR法均證實，應用GBE 2周后，TGF-β1及CTGF在腎間質中表達明顯減少，其mRNA表達量亦明顯低于UUO模型組大鼠，結果表明，GBE延緩腎間質纖維化的機制與其抑制TGF-β1/CTGF通路有關，這可能是GBE的治療靶點之一。