鞘氨醇1-磷酸鹽受體拮抗劑（FTY720）對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型皮膚中γδT細(xì)胞的作用研究

覃慧 鄭捷

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科 200025

目前銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但普遍認(rèn)為皮損中存在的炎癥性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）17A、IL-17F、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-22及分泌IL-23 的樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞在疾病發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1]。研究表明，缺乏γδT 細(xì)胞的小鼠在IL-23 或咪喹莫特（imiquimod，IMQ）刺激下皮膚表皮厚度和炎癥明顯減輕[2]，銀屑病小鼠模型真皮中的γδT 細(xì)胞具有遷移能力，在穩(wěn)定狀態(tài)下，小鼠淋巴結(jié)中部分分泌IL-17 的γδT 來(lái)源于皮膚，提示IL-17+γδT 細(xì)胞在皮膚和淋巴結(jié)間可能存在動(dòng)態(tài)變化[3-4]。皮膚淋巴細(xì)胞抗原（cutaneous lymphocyte antigen，CLA）特異性表達(dá)于具有組織遷移能力的細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞歸巢至組織。鞘氨醇1-磷酸鹽（sphingosine-1-phosphate，S1P）受體拮抗劑（FTY720）能有效下調(diào)表達(dá)于致病性T 淋巴細(xì)胞上的S1P受體1（S1P1），抑制細(xì)胞的遷移，降低炎癥因子的產(chǎn)生[5-7]，但其是否可通過(guò)阻斷組織之間致病性細(xì)胞的交流以緩解銀屑病的報(bào)道較少。本研究通過(guò)研究FTY720對(duì)銀屑病小鼠模型的治療作用及分子機(jī)制，為FTY720 進(jìn)一步應(yīng)用于銀屑病治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

IMQ（美國(guó)3M 公司），F(xiàn)TY720、膠原蛋白酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNA酶Ⅰ（美國(guó)Sigma公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司），胎牛血清（FBS，美國(guó)GIBCO公司），淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，美國(guó)Biowest公司），固定/破膜（Fixation/Permeabilization）工作液、10×洗液（10×Wash buffer）、高爾基體抑制劑（Golgiplug，美國(guó)Biolegend公司）。流式抗體為大鼠抗小鼠單抗，由美國(guó)Biolegend 公司生產(chǎn)，主要有Fc-blocker、PE 標(biāo)記的 CLA（CLA-PE）、Percp/cy5.5標(biāo)記的 CD3（CD3-Percp/cy5.5）、APC 標(biāo)記的 S1P1（S1P1-APC）、APC 標(biāo)記的γδ（γδ-APC）、APC/cy7 標(biāo)記的 Viability Dye（Viability Dye-APC/cy7）、PE/cy7標(biāo)記的IL-17（IL-17-PE/cy7）、PE/cy7標(biāo)記的γδ（γδ-PE-cy7）、PE/cy7 標(biāo)記的IgG1（IgG1-PE/cy7）、FITC標(biāo)記的CD45（CD45-FITC）、APC 標(biāo)記的Gr1（Gr1-APC）、PE/cy7標(biāo)記的CD11b（CD11b-PE/cy7）。40 μm無(wú)菌細(xì)胞篩（美國(guó)VWR公司），流式細(xì)胞儀（CantoⅠ，美國(guó)BD公司）。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 只 6 ～ 8 周齡、體重 18 ～ 20 g、SPF 級(jí)雌性C57BL/6 小鼠購(gòu)自美國(guó)Charles River 實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)于美國(guó)University of Louisville 動(dòng)物房SPF 環(huán)境，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)（Institution Animal Care and Use Committee：16574）。按小鼠體重隨機(jī)分為 2 組，小鼠每只耳朵涂抹10 mg/d IMQ，連續(xù)涂7 d，實(shí)驗(yàn)組3 只小鼠于第2（D1）、4、6 天腹腔注射FTY720，對(duì)照組5 只小鼠注射無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（1 × PBS，pH7.4）。PBS用量為200 μl，F(xiàn)TY720用量為1 mg/kg，溶于PBS[8]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由D0至D7每天測(cè)量鼠耳厚度，D7處死小鼠，取雙耳皮膚及雙側(cè)頸部引流淋巴結(jié)。腹腔注射FTY720及測(cè)量耳厚度均在當(dāng)天涂抹IMQ之前進(jìn)行。

三、方法

1.鼠耳朵皮膚組織病理：小鼠處死后取耳朵1 cm × 0.5 cm 皮膚組織，包埋冰凍組織塊，切片后-80 ℃保存。取冰凍切片行常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察。取冰凍切片，-20 ℃丙酮固定30 min，通風(fēng)干燥 30 min，置于 5 片式染缸，PBS 洗 3 次，滴加20% FBS，于4 ℃封閉過(guò)夜，PBS 洗1 次后加入Gr1單抗（1∶100稀釋），4 ℃避光過(guò)夜，PBS洗3次，吸取表面殘留水珠，滴加DAPI染色10 min，PBS洗3次，滴加防淬滅劑，封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

2.皮膚細(xì)胞獲取：處死小鼠后剪下雙耳皮膚并剪成肉糜狀，與皮膚消化酶（膠原蛋白酶Ⅳ、透明質(zhì)酸酶、DNA酶Ⅰ）中37 ℃旋轉(zhuǎn)消化2 h，采用2 ml針筒內(nèi)芯研磨，通過(guò)40 μm 無(wú)菌細(xì)胞篩，1 800 r/min（離心半徑14 cm，離心半徑下同）離心7 min，棄上清液。采用3 ml完全培養(yǎng)液（RPMI 1640，10%FBS）重懸，加入3 ml淋巴細(xì)胞分離液，于室溫下2 000 r/min離心15 min，吸取中間絮狀層和下層粒細(xì)胞層加入6 ml 完全培養(yǎng)液，1 800 r/min 離心 7 min，棄上清液。1 ml完全培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)后用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.頸部引流淋巴結(jié)細(xì)胞獲取：處死小鼠后沿腹中線剪開(kāi)小鼠皮膚直至下頜，取小鼠頸部淋巴結(jié)左右各 3 個(gè)置于 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液，2 ml 針筒內(nèi)芯研磨后通過(guò) 40 μm 無(wú)菌細(xì)胞篩，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液。1 ml 完全培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)后用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞比例：皮膚細(xì)胞懸液中取1×106個(gè)細(xì)胞，加入1ml PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入2 μl Fc-block 4 ℃孵育10 min。加入 Viability Dye-APC/cy7、CD45-FITC、Gr1-APC、CD11b-PE/cy7，4 ℃避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min 離心 5 min，棄上清液。加入100 μl PBS 重懸后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞比例。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)皮膚細(xì)胞中CD3+T、γδT細(xì)胞比例及淋巴結(jié)細(xì)胞中CLA、S1P1 的表達(dá)：皮膚細(xì)胞懸液或淋巴結(jié)細(xì)胞中取1×106個(gè)細(xì)胞，加入1 ml PBS，1 500 r/min離心5 min棄上清液。加入2 μl Fcblock 4 ℃孵育10 min。加入Viability Dye-APC/cy7、CD3-Percp/cy5.5、γδ-PE-cy7、CLA-PE、S1P1-APC，4 ℃避光孵育20 min，加入1 ml PBS，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液。加入100 μl PBS 重懸后FACS CantoⅠ檢測(cè) CD3+T、γδT 細(xì)胞比例及 CLA、S1P1表達(dá)。

6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+T、γδT 細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞比例：皮膚細(xì)胞懸液或淋巴結(jié)細(xì)胞懸液中取2×106個(gè)細(xì)胞，加入24孔培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基補(bǔ)足至1 ml，皮膚細(xì)胞懸液加入Golgiplug 1 μl，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h 后收集細(xì)胞至流式管。1 500 r/min 離心 5 min，棄上清液。加入2 μl Fc-block 4 ℃孵育10 min。加入CD3-Percp/cy5.5、γδ-APC、Viability Dye- APC/cy7、IL-17-PE/cy7 4 ℃孵育20 min。加入1 ml PBS 1 500 r/min離心5 min。盡量棄上清液后加入 400 μl 固定/破膜（Fixation/Permeabilization）工作液400 μl，室溫20 min。加入1 ml 1× 洗液1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，重復(fù)2 次。樣本管加入IL-17-PE/cy7，同型對(duì)照管中加入相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照，4 ℃冰箱孵育至少45 min。1 ml 1×洗液1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入100 μl 1 × 洗液重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17+CD3+T、γδT細(xì)胞的比例。所有流式結(jié)果應(yīng)用Flow J軟件分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的資料用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FTY720 對(duì)銀屑病小鼠耳朵皮膚組織學(xué)的影響

D2 時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠耳厚度明顯低于對(duì)照組（t=4.23，P＜ 0.01），直至D7 實(shí)驗(yàn)組小鼠耳厚度均低于對(duì)照組（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖1。

小鼠耳組織切片HE 染色顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠耳表皮厚度（18.62 μm ± 0.19 μm）低于對(duì)照組（27.79 μm ± 1.58 μm），t= 4.35，P＜ 0.01（圖 2A）。免疫熒光染色顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠耳組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度低于對(duì)照組（圖2B）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠耳組織中性粒細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞比例（1.57%±0.12%）低于對(duì)照組（3.03%±0.33%），t=3.31，P=0.016（圖2C）。

二、FTY720對(duì)銀屑病小鼠耳皮膚細(xì)胞、頸部引流淋巴結(jié)細(xì)胞中細(xì)胞比例的影響

流式結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚中CD3+、γδT細(xì)胞比例均低于對(duì)照組（t= 3.98、2.75，P＜ 0.05），見(jiàn)圖3，CD3+細(xì)胞、γδT 細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞比例亦均低于對(duì)照組（t= 6.89、10.27，P＜ 0.001），αβT 細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞比例與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.184，P= 0.86），見(jiàn)圖4。引流淋巴結(jié)中，實(shí)驗(yàn)組γδT 細(xì)胞比例高于對(duì)照組（t= 5.781，P= 0.001），γδT 細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞比例亦高于對(duì)照組（t=4.140，P=0.006），見(jiàn)圖5。

圖1 C57BL/6 小鼠耳涂抹咪喹莫特（IMQ）后腹腔注射FTY720 對(duì)耳厚度的影響 實(shí)驗(yàn)組n=3；對(duì)照組n=5。a：兩組比較，P ＜ 0.01

三、FTY720對(duì)引流淋巴結(jié)中γδT細(xì)胞S1P1及CLA表達(dá)影響

流式結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組γδT 細(xì)胞S1P1、CLA 平均熒光強(qiáng)度均低于對(duì)照組（t值分別為50.55、31.64，P＜ 0.000 1）。見(jiàn)圖6。

討 論

圖2 FTY720 對(duì)咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)銀屑病小鼠耳皮膚組織的影響 2A：實(shí)驗(yàn)組小鼠耳組織表皮厚度低于對(duì)照組（HE×10）；2B：免疫熒光染色顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠耳組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度低于對(duì)照組（圖中比例尺單位為50 μm）；2C：流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠耳組織細(xì)胞中中性粒細(xì)胞比例

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠耳皮膚CD3+、γδT細(xì)胞比例 a：兩組比較，P ＜0.05

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠耳皮膚CD3+細(xì)胞、γδT、αβT細(xì)胞中IL-17+細(xì)胞比例 兩組比較，a：P ＜ 0.05，b：P ＞ 0.05

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠引流淋巴結(jié)中γδT細(xì)胞及IL-17+γδT細(xì)胞比例 a：兩組比較，P ＜ 0.05

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)及腹腔注射FTY720后C57BL/6小鼠引流淋巴結(jié)中 γδT 細(xì)胞S1P1、CLA 平均熒光強(qiáng)度 實(shí)驗(yàn)組γδT 細(xì)胞S1P1、CLA 平均熒光強(qiáng)度均低于對(duì)照組（P ＜ 0.001）

銀屑病是一種機(jī)制未明的炎癥性皮膚病，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、控制炎癥因子產(chǎn)生及進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)是當(dāng)前銀屑病治療的主要策略[9]。目前針對(duì)IL-17及其受體的生物治療在治療銀屑病中已取得良好效果[10]。由于S1P1在細(xì)胞遷移浸潤(rùn)中發(fā)揮重要作用[11]，提示FTY720可通過(guò)抑制S1P1的表達(dá)減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以達(dá)到緩解銀屑病的目的。本研究顯示，F(xiàn)TY720 的使用可以顯著緩解銀屑病小鼠皮膚增厚，降低表皮厚度，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并降低皮膚中T細(xì)胞分泌IL-17水平，表明FTY720可以顯著緩解小鼠銀屑病臨床癥狀且能降低主要致炎因子IL-17的水平。既往研究表明，IL-23皮內(nèi)注射或IMQ局部涂抹誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中，真皮層中的γδT細(xì)胞是分泌IL-17的最主要細(xì)胞[12]。本研究采用IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型也發(fā)現(xiàn)，分泌IL-17的主要細(xì)胞是γδT 細(xì)胞，且FTY720 可顯著降低γδT細(xì)胞分泌IL-17水平，提示FTY720通過(guò)降低分泌IL-17 的γδT細(xì)胞來(lái)緩解銀屑病的癥狀。

S1P 與表達(dá)于多種免疫細(xì)胞上的S1P 1 ～5 結(jié)合以介導(dǎo)細(xì)胞遷移[13]。研究表明，F(xiàn)TY720 能通過(guò)抑制S1P1表達(dá)抑制特異性免疫細(xì)胞αβT細(xì)胞由淋巴結(jié)遷出，進(jìn)而顯著降低其在血液循環(huán)中的數(shù)量[14]，降低炎癥因子的分泌[5，15]。FTY720在小鼠腦梗死模型中也有很好的治療效果，可能的機(jī)制在于其能有效抑制γδT 細(xì)胞在腦部病灶的浸潤(rùn)[16]。但是γδT 細(xì)胞是否也是通過(guò)S1P1進(jìn)行遷移以及被抑制的γδT細(xì)胞去向如何均報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720 處理組 γδT 細(xì)胞表達(dá) S1P1 顯著下調(diào)，引流淋巴結(jié)中γδT、IL-17+γδT 細(xì)胞比例明顯升高，而皮膚組織中γδT、IL-17+γδT 細(xì)胞均明顯減少，提示抑制 γδT 細(xì)胞 S1P1 的表達(dá)可將 γδT 細(xì)胞限制于引流淋巴結(jié)而減少其在皮膚組織中的比例。而FTY720顯著下調(diào)引流淋巴結(jié)γδT 表面CLA 表達(dá)，也提示γδT細(xì)胞歸巢至皮膚組織能力降低。

本研究顯示FTY720的使用升高引流淋巴結(jié)中γδT 細(xì)胞比例，同時(shí)降低其在皮膚中的比例，提示FTY720可能有抑制引流淋巴結(jié)中γδT細(xì)胞向皮膚浸潤(rùn)的能力，隨后我們將進(jìn)一步對(duì)此觀點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型盡管是目前研究銀屑病最為廣泛的動(dòng)物模型，但不能完全代替人發(fā)生的銀屑病，因此研究FTY720 對(duì)人銀屑病的治療效應(yīng)及分子機(jī)制將是我們接下來(lái)工作的方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突