利用基因組數(shù)據(jù)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選與優(yōu)化

2019-08-05 08:06:40馮丹丹杜小燕陳振文

中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志 2019年7期

馮丹丹，陳沫，杜小燕，陳振文*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

長(zhǎng)爪沙鼠是源自我國(guó)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，因其獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)以及對(duì)微生物易感性等原因，已廣泛地應(yīng)用于腦神經(jīng)、微生物、營(yíng)養(yǎng)、代謝及腫瘤等諸多領(lǐng)域研究，被譽(yù)為“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但有關(guān)長(zhǎng)爪沙鼠的遺傳學(xué)研究相對(duì)較少，尤其是遺傳標(biāo)記物的開發(fā)和應(yīng)用遠(yuǎn)滯后于對(duì)其生物學(xué)特性和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用研究。目前國(guó)內(nèi)外僅有Neumann等[1]通過用克隆方法找到的9個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)并對(duì)野生長(zhǎng)爪沙鼠和人工飼養(yǎng)群體進(jìn)行了多態(tài)性分析。趙太云，譚元卿等[2-3]利用種間擴(kuò)增轉(zhuǎn)移法，在536對(duì)小鼠微衛(wèi)星引物中篩選出了長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn) 130 個(gè)。依據(jù)這些微衛(wèi)星位點(diǎn)，浙江省和北京市分別用28個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)建立了《長(zhǎng)爪沙鼠遺傳質(zhì)量控制》地方標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)也據(jù)此發(fā)布了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[6]。這有效解決了長(zhǎng)爪沙鼠遺傳質(zhì)量無據(jù)可依的狀態(tài)，也為長(zhǎng)爪沙鼠從實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物提升為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。但在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中遺傳質(zhì)量檢測(cè)所用的微衛(wèi)星位點(diǎn)存在一定不足，表現(xiàn)為個(gè)別位點(diǎn)多態(tài)性不夠高、個(gè)別位點(diǎn)擴(kuò)增效果不夠好、缺乏近交系遺傳檢測(cè)方法和位點(diǎn)等，因此有必要進(jìn)一步尋找更多和更有效的長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)。我們前期工作中對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠全基因組進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠基因組中存在大量重復(fù)序列，但是這些微衛(wèi)星能否成功擴(kuò)增和是否適于遺傳檢測(cè)尚不確定。本研究中我們根據(jù)微衛(wèi)星序列特征的標(biāo)準(zhǔn)選取了重復(fù)序列357個(gè)[7]，并根據(jù)這些序列的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終成功篩選出135個(gè)能有效擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過近交系和封閉群長(zhǎng)爪沙鼠基因組對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，優(yōu)化出適用于長(zhǎng)爪沙鼠近交系區(qū)分和封閉群遺傳分析的微衛(wèi)星位點(diǎn)。這些微衛(wèi)星位點(diǎn)的獲取進(jìn)一步豐富了長(zhǎng)爪沙鼠的遺傳信息，為建立長(zhǎng)爪沙鼠遺傳數(shù)據(jù)庫積累了數(shù)據(jù)[8]，同時(shí)為制定長(zhǎng)爪沙鼠近交系遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)一步完善和修改目前標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)，為下一步建立長(zhǎng)爪沙鼠遺傳質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取普通級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系F20代動(dòng)物各6只[9-10]，性別、年齡、體重不限，自行培育；普通級(jí)封閉群長(zhǎng)爪沙鼠12只，性別、年齡、體重不限，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。本實(shí)驗(yàn)通過首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.：AEEI-2017-032)，在實(shí)驗(yàn)過程中按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予動(dòng)物人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：Taq聚合酶、dNTP、10× PCR buffer和50 bp DNA marker(大連寶生物工程有限公司)；低熔點(diǎn)瓊脂糖(西班牙Biowest Agarose公司)。儀器：PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；PAC-30型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠圖像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；漩渦混合器(北京科爾德科貿(mào)有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 長(zhǎng)爪沙鼠基因組DNA的提取

將0.1 g肝組織切成片并置于2 mL組織消化緩沖液中，然后加入20 mg/mL蛋白酶K 10 μL，充分混勻后在55℃下消化12 h。然后用苯酚∶氯仿(比例=1∶1)萃取消化混合物，用乙醇沉淀DNA并溶解在TE緩沖液中。用Nanodrop 2000 C 微量分光光度計(jì)檢測(cè)所得DNA質(zhì)量，用TE溶液將已知濃度的DNA原液稀釋為50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆茫瑢NA原液保存于-80℃。

1.3.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇與引物合成

選擇位于長(zhǎng)爪沙鼠基因組序列中符合微衛(wèi)星標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)序列357個(gè)[4]，根據(jù)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼特異序列應(yīng)用Primer 5軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，每個(gè)位點(diǎn)2～4條引物，所有引物均由北京天一輝遠(yuǎn)有限公司合成。通過PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)以上位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定能成功擴(kuò)增的引物、最佳退火溫度和Mg2+離子濃度。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系的建立：總反應(yīng)體系20 μL，其中：10× buffer 2 μL，上下游引物(100 μmol/μL)各0.1 μL，dNTP Mg2+plus(100 μmol/L)1.2 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，基因組DNA(50～100 ng/μL) 1 μL，雙蒸水(ddH2O)15.4 μL。

PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，接72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。

1.3.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

稱取瓊脂糖2 g，加入到100 mL 0.5× TBE中，用微波爐加熱約5～10 min，自然冷卻至50℃左右，加入EB混勻，使EB終濃度為0.5 μg/mL，灌入插好梳子的凝膠槽中，約30 min后拔出梳子。將凝膠放入電泳槽中。吸取5 μL樣品加1 μL 6× loading buffer混勻,加入凝膠孔中。在凝膠樣品中央或兩側(cè)加入3～5 μL的50 bp DNA marker。電泳條件為120 V，35 min，將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選

針對(duì)預(yù)選出的357個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)其側(cè)翼序列合成了357對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，135個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)獲得成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(135/357，37.82%)，并篩選出引物的最適退火溫度，部分典型位點(diǎn)擴(kuò)增見圖1。 135個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的名稱、引物序列、目的片段大小、核心序列類型和重復(fù)次數(shù)及PCR反應(yīng)條件見表1。在篩選出的135個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)分別為112和23個(gè)，微衛(wèi)星核苷酸重復(fù)次數(shù)范圍為3～28次，目的片段大小范圍為51 ～ 271 bp。

注：A：ccmu152位點(diǎn)；B：ccmu183位點(diǎn)。M：50 bp marker；圖示數(shù)字為PCR反應(yīng)時(shí)所用退火溫度(℃)。圖1 典型的微衛(wèi)星位點(diǎn)退火溫度梯度優(yōu)化電泳結(jié)果(ccmu152和ccmu183兩個(gè)位點(diǎn))Note. A, Locus ccmu152. B, Locus ccmu183. M, 50 bp marker. Numbers represent annealing temperatures (℃).Figure 1 Typical electrophoretic map of annealing temperature gradient optimization for loci ccmu152 and ccmu183

表1135個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的名稱、引物序列、目的片段大小、核苷酸類型和重復(fù)次數(shù)及PCR反應(yīng)條件

Table1Sequencing and polymerase chain reaction (PCR) conditions of 135 microsatellite loci

(續(xù)表1)

位點(diǎn)Loci引物序列(上游)(5’→3’)Primer sequences (upstream)引物序列(下游)(5’→3’)Primer sequences (downstream)目的片段大小(bp)Target sequence size核苷酸類型和重復(fù)次數(shù)Nucleotide type and number of repetitions退火溫度(℃)Annealing temperatureMg2+濃度(mmol/L)Mg2+concentrationccmu152ACTGGGCATTGCAGGAACTTACAGTGGTCAGCCAAACACA231(TG)18601.5ccmu153GATGTCATGTATGTGTTACCAGTTTGGTCATTGCAGTGCCTTTCTAC222(TG)18601.5ccmu154AATATCCTGAGTCCTCTCACTCTCGCCCTGGACCATACACATATT214(AC)19601.5ccmu155AGCAGGCGAAAGCACTCCAAGAAGCCCATAGTGCTGGC269(AGG)13601.5ccmu156ATGGCTAATGCCCTGGTGGTCCTGTGGTAGTTGGGCAGTAA190(TAA)11601.5ccmu157TCCAAGGCGTCACCAAGTTCCCCGTCTTAGTTCTGTGGGT213(AT)18601.5ccmu158CTGTTCAGGCCTCCATGCTCGCTGAGACCATTTCTGCGATG197(AC)15601.5ccmu159TCCAGTTGTGTGGAAGGAAGTGTAGGCCTTGGTGTAGGACT208(CA)20601.5ccmu160TCTAACTGCTAAGGCCTGCTACACCCTAAGGAAGGGGAGC250(CAA)10601.5ccmu161ACGGTACACCTTGTCTAAGGCCGGAAATGGGGACTTAGGGG234(AC)13601.5ccmu162TCACCAGTGGAGTTTTGTCATCTGCCTTGAACACCGATAGAGA299(AC)13601.5ccmu163TACGATCTCAGTGATGTGCTGCACTGTTTGGCACAATGCTGG207(ATT)13601.5ccmu164AGTCTTTGGCCTTGTAGAGCTTTCAGGGAAGTGAAACATCAGCA136(AC)13601.5ccmu165ACTCTGGCTTCTGCCTTGACACTTCCCTTGCTTAGGTGGC258(AC)13601.5ccmu166CTGTTGGTAACATAGCAGGGCCCCCAACTTGACGATGACCA219(AC)13601.5ccmu167CCAGATATACTTGCTTTGTGAGGTGTTTTCATCTTTGCTGAACTTGG186(AC)13601.5ccmu168TCCGTGTCATTGCTGTGTGATTCATCTCCAACCTGTAGCACC261(AC)13601.5ccmu169TTGGCTTGTCTTCAGGGATTGAAAAGTTGGTCTCCCTTCGGT259(AC)13601.5ccmu170CAGACCACTGGATTGCAGGTTCCCGAAATGAACATATCTACCCT232(ATT)13601.5ccmu171TGCCATGTAAACATGAGAAACTAAGAGTGATCTCCAGGGATTTTTGT200(AC)13601.5ccmu172TCATCCATCTGAATCTTGGTCACAGGCACTTCTTGGCACATAGC205(AC)13601.5ccmu173GCCAGGACTACATAAGGCCACCCCCATAGACATGCCCACAAG214(AC)13601.5ccmu174CGCATAGGACAAGAGCAGGAAATTTCCACGCCACAGTCACC243(AC)13601.5ccmu175AGGGGGAGGGAGGGAGAAGCAAGCACTCCTTTAGATTACA198(AC)13601.5ccmu176GTAGGAGTCACTCAGTGGAAGAGAACTTCCCAAGTAGGAGACAGG192(AC)13601.5ccmu177AGCCAGAGCTGGATACTTAAGACAGACGAGGGTGGATAGACGTA198(AC)13601.5ccmu178ATGTCTGTTGAAGCAGGCAATGTGCGTATGTAGAGCATTTTTCC159(AC)13601.5ccmu179TTTCATGGGGACACAACCTGGACTAAGGATTGGACCTCTGGC200(AC)13601.5ccmu180TGGCTCCAGCAGTTGATGAGACAAGAAAAACAACATGCTCCTTA200(AC)13601.5ccmu181AAATGAGCGCACGCATGAGACAGGGTGCAAATGAGCAGAAG160(CA)15601.5ccmu182AGCTTGAAAGAACCAACACAGTTCTTCCCAGTTTTTCCTACCAACT217(CA)16601.5ccmu183GGGTAAAGCATCACCTGCCAAGCAGATGGCATCAGGTGTG250(CA)17601.5ccmu184TGGGCAAGTCAGTTGAAGCACATGGTGCAGATTCCCTCTGT219(CA)17601.5ccmu185TGGGTGAACTCCCAATTTTCTTCTTCATAGAAATTAACAGCTGCAT243(CA)17601.5ccmu186TCCCTTGGACTTTATGGGCAGCGCCCTCTCTAGGCCTAACTT241(CA)19601.5ccmu187AAAGCCTGTTTGGGCTACCTATCCGGTGCTCCTCACAGTA232(CAC)10601.5ccmu188CATCCCCACCAATAGGAGCCGGCCTGTTCAGTACAATCCCA184(CAT)11601.5ccmu189GCAAGTAAAGGGCTTGCAGTTGCCCTTAAGCATGGAAAGGA247(CAT)12601.5ccmu190ACGAGTTCTCCCCTAGCACAACTGTCTCCTTGGACAAGCC247(CAT)13601.5ccmu191ACTCCCATGGTCCTTTTGCCAAAGCCCTTAAGAAGCTGGGTT172(CTT)11601.5ccmu192CTGCTTCAGAGGAAAGGCAGAGCATCCAGATGGTGGTCCTTT217(AC)15601.5ccmu193CCCTCTCTAGGACTGTGCAATGCTCCAGCCCATCAATTAGG186(AC)15601.5ccmu194GCATTGGGGAAGGGCAATAGCACACCCAAGTGTTCAGGGT238(AC)15601.5ccmu195CACACCACACAGCCTAACCATCAGCCTGTGGGAACATTGAA240(AC)15601.5ccmu196TCTACTCCTTCTTTCCCCCTCCTTCGCCTTGTCTCTGTGAGAAT155(AC)15601.5ccmu197CGGCCTCAGTCACAACACATCCTTGTCTTTGTGGTTGATCCAT174(AC)15601.5ccmu198GCTTGTACCTTGGAAAGCTGGTGTTTCGTATGCTCACTTGCC150(AC)15601.5ccmu199ACTCCTTTTCACTCTCTTTGGATGTAGGGGGAGCTCATTTTGGA196(AC)15601.5ccmu200AAACCAAACCAAAAACACACTCCTTCTCCACCCAGGTCCTACAA169(AC)15601.5ccmu201CAGTTCACATCTGTGGGCAAAACCGCTAGAGGGCAGAGAAA240(AG)13601.5ccmu202TGATTTGCATGCATACTTCCCTCAACACTCCTGTCCTGCTGT259(AG)13601.5

(續(xù)表1)

位點(diǎn)Loci引物序列(上游)(5’→3’)Primer sequences (upstream)引物序列(下游)(5’→3’)Primer sequences (downstream)目的片段大小(bp)Target sequence size核苷酸類型和重復(fù)次數(shù)Nucleotide type and number of repetitions退火溫度(℃)Annealing temperatureMg2+濃度(mmol/L)Mg2+concentrationccmu203AGTGGCTGGAAACAACCCAACCTCTCACTGAACCAACGTCA318(AG)13601.5ccmu204ACTCCTACATTGAAGCCGTCTCGGTCACTATGGCCCCAGAAG222(AG)13601.5ccmu205GGATTGTGTCTGCAGGTCAGTATGATGCACCAGCCATAGGTT241(AG)13601.5ccmu206TGAGTGACTTGAGTGACAGTACCTGTGACTGGATGAGGCTTGC224(AG)13601.5ccmu207TCAGGAAAACCAAAACAAATTGGAACTTTCCTTTCCCCACCGGAT302(AG)13601.5ccmu208GAGCTGTGTGAGGACCAGTTTGTCTGAGTGCTTTGACAACGTAT172(AC)5601.5ccmu209CAGCCCCAAGCCAAAGGTTTTTGCCAACTGGGTGGGATAAGA200(AC)5601.5ccmu210GACAGGCTCTAGCAGCAGAAATACAGTCACAGGAGAGTGCT186(AG)13601.5ccmu211CTTCTGATCATTCCCTGCGTGTCTCTGGTGCCTGCCTCTAA152(AC)13601.5ccmu212CTGTTCACCATTCACTTAACACCAAGGCTGATGAAAGTTGCCCT156(AC)13601.5ccmu213TACAGAACACAGATATTGGGCACATACACCCACCTCAAATGCG199(AC)5601.5ccmu214TCCCTATGCCTCTTCCCTAGTCTAGTAAGAGGGGCAGGGGATG170(AC)5601.5ccmu215GAGGGACCATAGGAAGCAGAAGACTCCCACATGTCACCCCA52(AC)5601.5ccmu216TTCACAGGTACAGTCATGGGCCAACAAGTGGTCTTGTCAGAAA63(AC)5601.5ccmu217TCTTGCTCTCTATCCCTCTCCATCCAGACTCAGAAAGGCAACC126(AC)5601.5ccmu218AGTAGCCATTTGCATGAGGACATTCCCTAGTGATCTATTGGGTTGG137(AC)5601.5ccmu219TGACTCTTGTGAGCTATCCTCTGTGCTACCTTCTGTCCTCCTCA180(AC)5601.5ccmu220CACGCAGGTGCTTATCTCCACAGGGTGAACAGAACGAGGT136(AC)5601.5ccmu221ACCCTCATTTCATACCCTGCCATTGGCCATTGGGCATAGCA271(CA)20601.5ccmu222AAAACTCCTCGGGAAGGTGGACGAATTTGGGGCGCATAAG289(CA)20601.5ccmu223ATGCCTGTGTTGTATCAGGCTCCAGGTTTTCCCAGGTTCAC208(CA)20601.5ccmu224TGCTGACCCCTACTCACAGTGCCTTGGTTCTTAGAAAGCCC246(CA)20601.5ccmu225TATGGTTCTTGCAGAGGGCGTGCATGGAAATTGATCCGCT283(CA)20601.5ccmu226CCCGGGGTCTGTGTACAATCAGCTGTCGTCTTGACTGTGTT240(CA)20601.5ccmu227ATGTTAACCACCACGGGTCCCGTGTCCAGTAGGAGGTTGT249(CA)20601.5ccmu228TAAACAAGAGCTGGGTGCCTCCCCTCATGGGCAGAACGAA300(CA)20601.5ccmu229TTGCGATGCACATGAAGTGATTTTATCCTCCGTGCTCCCG232(CAC)12601.5ccmu230ACATGTTTCCAATTGGGCTGCACTGCTTTCAGAATGGATTTTTGT239(CA)20601.5ccmu231GTCTGGGCTTGTCTAGGTGCTCCCAGGACTGTGGCCTATT242(TC)22601.5ccmu232TGACAACAGCCAGCACAGAGCCAGATTGGTTCCAAACAGCAG259(TC)22601.5ccmu233AGTCACGCGGGAGTAGAACTGCTCTCCTTGTGGAGACCCT191(TC)22601.5ccmu234AATGGGGGCCATCTTCTCCACGCTGTCTTGTGTGTCATCC177(TC)22601.5ccmu235CCTGGTGTACTCCATTTGCTCTGTGCGTTGTCCAGTTGTCTT243(TC)22601.5ccmu236GAAGAGGCTACACGATGGGGAGCCTTGGTGTTTCAGTTTCA231(TC)22601.5ccmu237CTCCTGTGCAGGCACACTTAGATCCCAGCACCCACAGAAG307(TC)22601.5ccmu238TGTGTCAGCCATAAGTCCCCAACTGGGGCACTGTCAACAT279(TC)22601.5ccmu239ACACCATGGATAAAGACCCTGTAAACTTTCTTCAGCTTCCACT114(TC)22601.5ccmu240TGTGGGATACTGGTGCACTGCTGCTTTCCAGTTGTGGTGC234(TC)22601.5ccmu241CTGTTAGCACGGGACTGACTAGACATTATGGCTTGTTCCCCA226(TC)22601.5ccmu242GATGCCTGGTCCCCAATCTTCTGTTCGAGAAATGGCCACC287(TC)22601.5ccmu243GCCTCGTTGGAGAAAGTGTGAAGACACCATGACCACAGCAA164(TC)22601.5ccmu244GGGCCAGCTGATGCTTAGATTTGGTGCTAACATTCCTGGCA144(TC)22601.5ccmu245CCACTGCCACTGTTTACCCAGGTCTGTCTGTTAGATCTGCCAAT277(TC)22601.5ccmu246GGACTTGTGGCCTTGTAGGAGGGTCATCGTGGAGAGCATGG272(TC)22601.5ccmu247AGGTATGGCCTCGTTAGAGGAGTGTCAGAGGGTTAGAGTCCAT232(TC)22601.5ccmu248TACCTGGAGGGGCAGCTAAAGATCATGCCTAAGGGGGAGG343(TC)22601.5ccmu249GAGTTGGGAAAACTCAGCGTTCCCAAGTTTTCTTTTTCATCACTG245(TC)22601.5ccmu250TCCCTAGACCTGCAAAACCACACCCCCATCCCAAGATTCCTA214(TC)22601.5ccmu251TTGTGTCTAATTCCCTCCTCCCGTGCTTCTCTACCGGGTACT152(CA)22601.5ccmu252CCTAGACAGAAACAAGGGCCACCCCACAAAGCACTGATTAGC224(CA)22601.5ccmu253ACTGGGGACCATGGTAAGTCTATTACCTTTGTGGAGTACTTGGT277(ATT)3601.5

(續(xù)表1)

注：A：引物ccmu138的PCR產(chǎn)物；B：引物ccmu218的PCR產(chǎn)物。M：50 bp marker；A1 ～ A6：長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血模型；B1 ～ B6：長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病模型。圖2 兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn) ccmu138和ccmu218的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Note. A, PCR product of ccmu138 primers. B, PCR product of ccmu218 primers. M, 50 bp marker. A1-A6, Cerebral ischemia Mongolian gerbils. B1-B6, Diabetic Mongolian gerbils.Figure 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products for loci ccmu138 and ccmu218

2.2 適于長(zhǎng)爪沙鼠近交系區(qū)分的微衛(wèi)星位點(diǎn)優(yōu)化

選取本課題組自行培育的長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系F20代動(dòng)物各6只，通過135個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)在同一品系內(nèi)均呈單態(tài)性，而有10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在2種模型品系間存在差異，包括ccmu138、ccmu146、ccmu156、ccmu161、ccmu175、ccmu189、ccmu218、 ccmu235、ccmu250和ccmu261。這些位點(diǎn)可將長(zhǎng)爪沙鼠2種模型近交系品系區(qū)分開來，圖2為2個(gè)位點(diǎn)對(duì)不同近交系的擴(kuò)增結(jié)果。

2.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性優(yōu)化

應(yīng)用135個(gè)篩選出的長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)引物對(duì)12只封閉群長(zhǎng)爪沙鼠樣本進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果有23個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)出現(xiàn)多態(tài)性，包括ccmu148、ccmu151、ccmu163、ccmu164、ccmu165、ccmu176、ccmu183、ccmu187、ccmu190、ccmu192、ccmu198、ccmu201、ccmu214、ccmu231、ccmu232、ccmu233、ccmu241、ccmu244、ccmu248、ccmu249、ccmu264、ccmu267和ccmu269微衛(wèi)星位點(diǎn)，圖3顯示ccmu148和ccmu176位點(diǎn)對(duì)12只封閉群動(dòng)物的擴(kuò)增結(jié)果，兩個(gè)位點(diǎn)在封閉群多個(gè)樣品中顯示多態(tài)性。

3 討論

微衛(wèi)星DNA也稱為簡(jiǎn)單重復(fù)的DNA片段，其重復(fù)單位一般為1 ～ 6 bp，重復(fù)數(shù)為10 ～ 20次左右，在哺乳動(dòng)物基因組中隨機(jī)分布。由于其具有在基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、易于檢測(cè)、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，成為第二代遺傳標(biāo)記物。微衛(wèi)星在評(píng)價(jià)遺傳多樣性、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹、連鎖分析、疾病診斷和親子鑒定等方面顯示出巨大優(yōu)勢(shì)，并在動(dòng)植物的遺傳研究中得到了廣泛應(yīng)用[11-12]，并成為一種重要的、成熟的遺傳學(xué)檢測(cè)工具廣泛應(yīng)用于各類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)研究中[13-14]。

注：A：ccmu148引物的PCR產(chǎn)物；B：ccmu176引物的PCR產(chǎn)物。M：50 bp marker；1 ～ 12：封閉群長(zhǎng)爪沙鼠。圖3 兩個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)ccmu148和ccmu176的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Note. A, PCR product of ccmu148 primers. B, PCR product of ccmu176 primers. M, 50 bp marker. 1-12, outbred group of Mongolian gerbils.Figure 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products for the loci ccmu148 and ccmu176

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在大、小鼠遺傳多態(tài)性的研究已經(jīng)取得較好成果，但長(zhǎng)爪沙鼠開發(fā)出的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量較少。除Neumann等[1]通過用克隆方法找到的9個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)外，本實(shí)驗(yàn)室利用種間擴(kuò)增轉(zhuǎn)移法，在536對(duì)小鼠微衛(wèi)星引物中篩選出了長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn) 130 個(gè)，并已登錄到GenBank中[2-3]。我們利用國(guó)內(nèi)外篩選的139個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)通過封閉群長(zhǎng)爪沙鼠進(jìn)行多態(tài)性分析，優(yōu)化出了28個(gè)具有多態(tài)性的位點(diǎn)，以此為依據(jù)建立了封閉群長(zhǎng)爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法，并被浙江省和北京市長(zhǎng)爪沙鼠遺傳質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)和中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所采納[4-6]。在建立長(zhǎng)爪沙鼠遺傳檢測(cè)方法時(shí)，由于可供選擇的位點(diǎn)數(shù)量少，為了能真實(shí)地反映群體遺傳概貌，不得采用更多的位點(diǎn)組合，使一些僅有2個(gè)等位基因的位點(diǎn)也納入了其中。這大大增加了工作量，也使得檢測(cè)周期延長(zhǎng)和耗費(fèi)過多。同時(shí)，以往尚未見有對(duì)近交系長(zhǎng)爪沙鼠遺傳檢測(cè)方法的研究報(bào)道，因此有必要篩選更多的長(zhǎng)爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)為下一步補(bǔ)充和完善目前的長(zhǎng)爪沙鼠遺傳檢測(cè)方法及建立近交系長(zhǎng)爪沙鼠遺傳檢測(cè)方法提供候選位點(diǎn)。

本研究中我們通過分析長(zhǎng)爪沙鼠全基因組的測(cè)序結(jié)果，選擇符合微衛(wèi)星標(biāo)準(zhǔn)的位點(diǎn)357個(gè)，并根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼序列合成相應(yīng)的引物，能夠針對(duì)性地篩選適用于長(zhǎng)爪沙鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)，優(yōu)于實(shí)驗(yàn)室前期利用種間擴(kuò)增轉(zhuǎn)移的方法。我們首先用長(zhǎng)爪沙鼠混合基因組對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在357個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中成功擴(kuò)增出135個(gè)條帶清晰且無雜帶的微衛(wèi)星位點(diǎn)，包括112個(gè)二核苷酸位點(diǎn)和23個(gè)三核苷酸位點(diǎn)。其余222個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)沒有擴(kuò)增出理想條帶，擴(kuò)增失敗的原因可能為以下方面：所設(shè)計(jì)的引物特異性不佳，形成引物二聚體從而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增條帶；模板DNA的質(zhì)量也能影響個(gè)別位點(diǎn)的擴(kuò)增，尤其是對(duì)相對(duì)較長(zhǎng)的微衛(wèi)星片段的影響更加明顯。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠近交系是腦缺血研究良好的模型動(dòng)物，也是理想的II型糖尿病模型，兩種模型的建立不但豐富了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，也為研究人類疾病的機(jī)制與藥物開發(fā)提供良好的模型材料。所以本研究利用篩選出的135個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析已知的長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系動(dòng)物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果多數(shù)位點(diǎn)為單態(tài)性，尤其在同一品系內(nèi)均為一致的電泳圖帶。而2個(gè)品系間有10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)存在差異，能區(qū)分長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系群體，對(duì)于模型動(dòng)物的推廣應(yīng)用具有重要的意義。由于這2個(gè)近交系均來源于20代前的共同父母，是在F7代時(shí)分離培育成2個(gè)品系，因此遺傳背景很大程度上是一致的，以往的遺傳檢測(cè)方法很難將其區(qū)分，說明這10個(gè)位點(diǎn)可用于近交系的遺傳監(jiān)測(cè)。遺傳多樣性是生物多樣性的核心和重要組成部分，對(duì)遺傳多樣性的研究有利于了解物種或種群的進(jìn)化歷史和分類地位，為資源的保存與利用提供理論依據(jù)。封閉群動(dòng)物群體中存在遺傳多樣性，選擇用于群體遺傳分析的微衛(wèi)星位點(diǎn)更加注重其多態(tài)性，即等位基因數(shù)量越多，其所蘊(yùn)含的信息量越大，遺傳分析的結(jié)果更加真實(shí)可靠。為了建立有效的長(zhǎng)爪沙鼠群體遺傳檢測(cè)方法，開展長(zhǎng)爪沙鼠群體遺傳多樣性分析，本研究隨機(jī)選取了長(zhǎng)爪沙鼠封閉群動(dòng)物12只，應(yīng)用篩選出的135個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果有23個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，一共發(fā)現(xiàn)了63個(gè)等位基因，其中等位基因數(shù)最多的達(dá)6個(gè)。這為補(bǔ)充和完善封閉群長(zhǎng)爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法提供了新的可供選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)。