CCR5介導小鼠肝癌微環境中骨髓來源抑制性細胞的遷移

許雅蘋，鄭曉輝，吳 春，伊 雪，黃黎月，王玉孝*

(1.廈門醫學院基礎醫學部 福建 廈門 361023； 2.機能與臨床轉化福建省高等學校重點實驗室 福建 廈門 361023； 3.廈門醫學院呼吸疾病研究所 福建 廈門 361023)

腫瘤微環境中免疫網絡的失調是腫瘤免疫逃逸的重要原因之一。其中骨髓來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)在腫瘤微環境中起重要作用[1]。MDSCs是近年來發現的一群未分化完全的骨髓來源異質性細胞，具有免疫抑制功能[2]。在小鼠中MDSCs表達CD11b和Gr1，并可分為單核細胞型Mo-MDSCs (CD11b+Ly6G+Ly6Chigh)和粒細胞型G-MDSCs (CD11b+Ly6G+Ly6Clow)[3]。MDSCs可通過活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的產生以及程序性死亡配體1(PD-L1)和精氨酸酶(ARG-1)的表達抑制T細胞和NK細胞的抗腫瘤功能[4]，而腫瘤和基質細胞長期分泌各種炎癥因子促進腫瘤病變中MDSCs的產生，募集和活化[5]，因此抑制MDSCs在腫瘤部位的聚積是治療腫瘤的一種新思路。

在肝癌患者中MDSCs大量的升高[6]。趨化因子通過與特異性跨膜G蛋白偶聯的C-趨化因子受體的相互作用來調節淋巴細胞和骨髓細胞的運輸。大量研究表明多種趨化因子/趨化因子受體參與MDSCs向腫瘤微環境的募集。據報道，在橫紋肌肉瘤中，CXCR2缺乏可以阻止CD11b+Ly6GhiMDSC遷移至腫瘤[7]，而CXCR2的缺失減弱了MDSCs向結腸粘膜和腫瘤的浸潤[8]。此外，也有研究報道CXCR2配體促進PMN-MDSC向腫瘤部位的遷移[9]。CCL2與其受體CCR2，CCR4和CCR5之間的相互作用參與黑素瘤，乳腺癌和前列腺癌中Mo-MDSCs的募集。

CCR5 (C-C chemokine receptor type 5)是結合三種趨化因子的關鍵CCR：CCL3(MIP-1a)，CCL4(MIP-1b)和CCL5(RANTES)[10]。CCR5抑制劑被證明可抑制胰腺癌[11]、前列腺癌[12]和乳腺腫瘤[13]的生長和轉移。在患有結直腸癌肝轉移患者中，maraviroc對CCR5的阻斷誘導了腫瘤相關巨噬細胞的復極化，并獲得了一定的臨床進展[14]。然而，CCR5及其配體在MDSCs動員和肝癌微環境中的作用知之甚少。本文主要目的在于探索肝癌微環境中CCR5對MDSCs在肝癌微環境中遷移的影響，尋找肝癌治療的新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠，雄性，體重 18～22 g，2月齡。由廈門大學實驗動物中心提供[SCXK(閩)2018-0003]，飼養于廈門大學實驗動物中心[SYXK(閩)2018-0009]。本研究由廈門醫學院實驗動物倫理委員會審批準，編號：20160309106，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.1.2 細胞

H22小鼠肝癌細胞株由福建省慢性肝病肝癌重點實驗室提供。

1.2 主要試劑與儀器

流式細胞抗體大鼠抗小鼠的APC CD11b，PE Gr-1，FITC Ly-6G，PE Ly-6C購自美國BD公司，紅細胞裂解液購自Hyclone公司，MDSCs分選試劑盒購自德國美天旎(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)，DiR染料購自Invigrogen，CCR5抑制劑Maraviroc購自Sigma-Aldrich。小動物活體成像檢測儀(Caliper Life Sciences, Perkin Elmer, Lumina III)；流式細胞儀(Beckmann Cytoflex)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

小鼠肝癌細胞H22培養于90% RPMI 1640、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的完全培養基中，并于37℃、5%CO2、95%相對濕度的恒溫培養箱中培養。

1.3.2 脾細胞分離

取小鼠脾細胞于300目的尼龍布上，加入預冷的2 mL RPMI-1640基礎培養基，用研磨棒輕輕按壓研磨后收集細胞懸液，1500 r/min 4度離心5 min，去上清后用2 mL紅細胞裂解液破紅3 min，用預冷的2 mL RPMI-1640全培終止，離心后預冷的10 mL 0.5% FBS-PBS洗1遍。

1.3.3 MDSCs分離純化

MDSCs分選采用美天旎小鼠MDSCs分選試劑盒。分離荷瘤小鼠脾細胞約1×108個，用buffer重懸制備成單細胞懸液。用300目細胞濾網過濾后1500 r/min，4℃ 離心10 min。去上清后，用700 μL Buffer重懸細胞，轉移到1.5 mL EP管，加入70 μL FCR 抗體阻斷劑(FCR blocking reagent)，4℃旋轉混勻孵育10 min。孵育后直接加入100 μL生物素化抗Gr-1的抗體(biotin-conjugated anti-Gr-1 antibody), 4℃旋轉混勻孵育15 min；孵育完后細胞用10～20 mL buffer重懸，再次1500 r/min，4℃ 離心10 min去上清。800 μL buffer重懸細胞，加入100 μL 抗鏈霉素的磁珠(anti-streptavidin micobeads)，4℃旋轉混勻孵育15 min；孵育完后細胞用10～20 mL buffer重懸，1500 r/min，4℃ 離心10 min；離心后去上清，細胞用2 mL buffer重懸細胞過柱，此步洗脫下來的細胞即為MDSCs。

1.3.4 細胞遷移實驗

分選純化后的MDSCs接種于小室上層，5 × 105/孔，下室加入1% FBS的1640或H22的條件培養基(tumor conditional medium, TCM)，CCR5抑制劑組的MDSCs在接種前用CCR5抑制劑Maraviroc 100 nmol/L預處理2 h。接種5 h后收集小室細胞計數，并加入流式抗體APC CD11b，FITC Ly-6G，PE Ly-6C對遷移下來的MDSCs亞群進行分析。

1.3.5 小鼠肝癌原位模型建立

正常BABL/c小鼠麻醉后仰臥位固定，在肝左外葉包膜下注射H22肝癌細胞懸液(5×105/25 μL)，見注射部位起一個小泡，證明注射成功[13]。10 d后將小鼠處死，取小鼠脾、骨髓、肝進行流式分析。

1.3.6 小動物活體成像

成功建立肝癌原位模型的小鼠8只，隨機分成兩組，每組4只。對照組尾靜脈注射對照的MDSCs，CCR5抑制劑組尾靜脈注射100 nM Maraviroc預處理的MDSCs 3×106cells/只。24 h后小動物活體成像檢測，數據分析采用Living Image Software (Caliper Life Sciences, CA)。

1.3.7 流式細胞檢測

將細胞懸液制備成5×106/mL，取100 μL細胞加入相應抗體，4度避光孵育相應時間后上機檢測。MDSCs檢測使用抗體：APC CD11b、PE Gr-1， MDSCs亞群抗體APC CD11b、PE Ly-6C、FITC Ly-6C。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 原位肝癌模型中MDSCs的增殖

為了研究MDSCs在肝癌微環境中的增殖，我們建立了肝癌原位模型。10 d后將小鼠處死，并通過流式檢測小鼠骨髓、脾、肝中MDSCs的情況。由結果可以看到，不論是骨髓、脾還是肝，與正常小鼠相比，MDSCs都顯著性升高(圖1)。這說明，在肝癌微環境中，MDSCs顯著增加。MDSCs升高可能為肝癌的生長提供了有利的免疫微環境。

注： A：流式分析MDSCs在正常小鼠和原位肝癌模型小鼠中的情況；B：MDSCs在骨髓、脾、肝中的比例。與正常組相比，**P<0.01, *** P<0.001。圖1 肝癌原位模型中MDSCs的增殖Note. A, Representative fluorescence-activated cell sorter analysis of MDSCs in the normal and hepatoma-bearing mice. B, Frequency of MDSCs in bone marrow, spleen, and liver. Compared with the normal group, **P<0.01, ***P<0.001.Figure 1 MDSCs were increased in the mouse orthotopic liver cancer model

2.2 體外肝癌細胞通過CCR5誘導MDSCs遷移

肝癌原位模型中MDSCs在肝癌的增殖可能為肝癌細胞的生長提供了有利的條件，因此研究肝癌細胞如何誘導MDSCs在肝中增殖有十分重要的意義。我們接著通過遷移實驗來研究肝癌細胞誘導MDSCs遷移。我們分選了來自荷瘤小鼠脾的MDSCs，分選前荷瘤小鼠脾MDSCs的比例為14.2%，經過磁珠分選后回測MDSCs的純度為94.5%(如圖2A)。流式檢測MDSCs的CCR5陽性率為85.1%(如圖2B)。接著我們用分選得到的MDSCs進行遷移實驗，如圖2C所示，在遷移小室的下室接1640培養基或小鼠肝癌細胞H22的條件培養基(TCM)，將MDSCs接種在遷移小室上面，5 h后收集下室的細胞進行計數。如圖2D所示，TCM顯著誘導MDSCs遷移，而經CCR5抑制劑Maraviroc處理過的MDSCs其遷移能力顯著下降，這說明CCR5可能在TCM誘導MDSCs遷移的過程中起重要作用。

注： A：磁珠分選高純度MDSCs；B：分選后的MDSCs表達CCR5；C：體外遷移實驗模型圖；D：下室中MDSCs遷移數。**P<0.01,***P<0.001。圖2 體外TCM通過CCR5誘導MDSCs遷移Note. A, Purity of MDSCs was analyzed after sorting. B, CCR5 expression was analyzed by flow cytometry. C, Schema of the Transwell culture system for in vitro assay. D, Number of MDSCs in the lower chamber. **P<0.01, ***P<0.001.Figure 2 TCM-promoted MDSC migration through CCR5 in vitro

2.3 體外肝癌細胞通過CCR5誘導MDSCs亞群遷移

接著我們應用流式對遷移到下室中的MDSCs亞群進行分析。在遷移之前，即分選純化后MDSCs亞群的比例為G-MDSCs為83.4%，而Mo-MSDCs為16.0%(如圖3A)。經遷移后在1640培養基中G-MDSCs遷移的比例為98.4%，而Mo-MDSCs的比例為1.48%，這說明G-MDSCs的遷移能力比Mo-MDSCs強(如圖3B)。在TCM的誘導下G-MDSCs 和Mo-MDSCs遷移數與1460組相比有顯著性升高，如圖3C所示，而經CCR5抑制劑處理后G-MDSCs 和Mo-MDSCs遷移數與TCM組相比也有顯著性下降，說明CCR5可能在TCM誘導MDSCs亞群遷移的過程中都起重要作用。

注： A：遷移前MDSC亞群的比例；B：流式分析下室中MDSC亞群遷移情況；C：MDSC亞群遷移細胞數。**P<0.01,***P<0.001。圖3 體外TCM通過CCR5誘導MDSC亞群遷移Note. A, Proportion of MDSC subsets before migration. B, Flow cytometric analysis of the subsets of MDSCs in the lower chamber. C, Number of MDSCs in the lower chamber. **P<0.01, ***P<0.001.Figure 3 TCM promoted MDSC subset migration through CCR5 in vitro

2.4 活體成像檢測MDSCs在體內遷移情況

為了驗證肝癌微環境中MDSCs的遷移及CCR5在肝癌微環境下對MDSCs遷移的影響，我們先建立了原位肝癌模型小鼠，并將小鼠分為兩組。10 d后用DiR標記的MDSCs通過原位肝癌模型小鼠尾靜脈回輸到小鼠體內，24 h后通過IVIS觀察MDSCs在小鼠體內遷移情況。實驗組MDSCs標記前先用Maraviroc 100 nmol/L預處理。結果如圖4A可見MDSCs主要定植到小鼠的肝和脾，且CCR5抑制處理的MDSCs其遷移能力變弱。我們又將小鼠的肝和脾取出，分別檢測MDSCs在肝和脾的定植情況。結果顯示，實驗組的肝和脾內的MDSCs與對照組相比顯著性降低，見圖4B和4C。這說明在肝癌微環境中，CCR5對MDSCs遷移有重要作用。

注： A: MDSCs在肝癌原位小鼠體內遷移的主要部位； B：MDSCs遷移到肝中的情況；C：MDSCs遷移到脾的情況。*P<0.05。圖4 活體成像檢測MDSCs在體內遷移情況Note. A, Major portion of MDSC migration in mice with in situ liver cancer. B, Migration of MDSCs into the liver. C, Migration of MDSCs into the spleen. *P<0.05.Figure 4 Migration of MDSCs in vivo was detected by an in vivo imaging system

3 討論

近年來，人們發現在多種腫瘤患者以及小鼠腫瘤模型MDSCs顯著性增加。由于MDSCs能夠通過不同的機制抑制T細胞和NK細胞介導的抗腫瘤免疫反應的能力，參與腫瘤免疫負調控，因此MDSCs是腫瘤微環境中重要的免疫抑制細胞[15]。目前已證實了多種炎癥因子參與MDSCs擴增和遷移，比如VEGF，GM-CSF，IL6 CCL2，S100A8和S100A9等。CCL2 / CCR2，SDF-1 / CXCR4，CCL5/CCR5途徑對于在乳腺癌、肺癌、卵巢癌和黑色素瘤環境中MDSCs的募集至關重要。然而，介導MDSCs募集到肝癌微環境的具體機制尚不完全清楚。

為了更好地研究MDSCs在肝癌微環境中募集的機制，我們采用了小鼠原位肝癌模型，其肝環境比皮下腫瘤模型更接近臨床。我們結果顯示在肝癌微環境下，MDSCs在骨髓、脾、肝中都顯著性升高。有研究報道，CCR5通過與其配體趨化因子CCL5相互作用參與腫瘤生長，侵襲，血管生成和免疫細胞向腫瘤微環境的募集[16]。我們前期研究也表明了MDSCs高表達CCR5[17]。因此，我們猜想MDSC是否通過CCR5募集到肝癌微環境中。為了研究我們MDSCs在肝癌微環境中募集的機制，我們分選并獲得了高純度的MDSCs。MDSCs的分選方法有多種，我們曾經對比報道了多種MDSCs分選方法[18-19]。本文的研究需要用到較多的MDSCs，且后續用于流式及活體成像分析，因此選用磁珠分選的方法以較快地獲得大量的MDSCs用于后續實驗。

最近的一項研究表明，CCL2分別在膠質瘤微環境中通過CCR2募集Ly-6C+單核細胞MDSCs[20]，這表明MCP-1 / CCR2在誘導Mo-MDSC遷移中起著至關重要的作用。通過體外遷移實驗，我們發現抑制MDSCs的CCR5后其遷移能力顯著性降低，而且其對MDSCs亞群的遷移能力也有顯著抑制作用。這表明，CCR5在肝癌細胞吸引MDSCs遷移的過程中起重要作用。有趣是，據報道，由黑素瘤浸潤的MDSCs產生的CCR5配體在體外和體內吸引表達CCR5的Treg[21]。此外，腫瘤分泌的這些趨化因子不僅誘導CCR5+細胞的運輸，而且還上調其表面上的CCR5表達。后續我們將對肝癌細胞是否影響MDSCs的CCR5表達進一步深入研究。

由于CCR5對細胞遷移的重要性，CCR5及其配體被認為是腫瘤治療靶標。據報道， CCR5抑制劑Maraviroc在結腸直腸癌細胞中介導細胞毒性和凋亡作用[22]，減少胃癌細胞傳播[23]，抑制前列腺癌和乳腺癌細胞的轉移[23-24]。此外，CCR5靶向誘導結腸直腸癌患者中腫瘤相關巨噬細胞的復極化[14]并抑制B16黑素瘤小鼠模型中的MDSCs活性[26]。靶向CCL5可降低乳腺癌中MDSCs的功能，從而抑制腫瘤進展[27]。我們在肝癌原位小鼠模型體內證實CCR5作為肝癌治療靶標可能性。我們抑制MDSCs的CCR5，再將其回輸到小鼠原位肝癌模型體內，發現遷移到小鼠肝及脾的MDSCs數量變少，表明其遷移能力一定程度上受損，遷移至腫瘤部位的MDSCs變少后其對腫瘤免疫逃逸的貢獻也將會受到一定的影響。

綜上所述，本研究表明CCR5介導MDSCs向肝癌原位模型小鼠的腫瘤和脾部位遷移，抑制MDSCs的CCR5可以減少MDSCs在肝的聚積，從而改善肝癌的微環境。