高效液相色譜法測定食品中脫氫乙酸含量的方法優化

□吳寧寧 高運通

脫氫乙酸及其鈉鹽，作為常用食品防腐劑代表，被廣泛應用于果蔬汁、糕點、醬菜等，以高效、低毒、廣譜而著稱，對酵母菌、霉菌具有較強的抑菌能力，但脫氫乙酸及其鈉鹽能夠快速被人體吸收，分散在器官與血液中，對多種氧化酶具有一定的抑制作用，影響人體健康，為此食品安全國家標準對不同種類食品中脫氫乙酸及其鈉鹽的含量限值進行了明確規定，其允許添加的最大限值為1.0g/kg。國標GB5009.121-2016規定了脫氫乙酸含量檢測方法，其中氣相色譜法方法比較復雜，重復性差，影響因素多，故常用高效液相法對食品中脫氫乙酸及其鈉鹽進行含量測定，但按照國標方法提供的液相條件進行檢測，色譜峰拖尾嚴重，前處理過程復雜，為此筆者對樣品前處理及色譜條件進行了優化，經優化色譜峰拖尾有了明顯的改善、前處理過程更加簡單快捷。

一、主要儀器設備和試劑

高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，配備二極管陣列檢測器與紫外檢測器)、離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，轉速4,000r/min)、分析天平(上海天美天平儀器有限公司，靈敏度0.001g)；甲醇(默克，色譜級)、磷酸(國藥，優級純)、乙酸銨(阿拉丁，色譜級)；脫氫乙酸標準儲備溶液(準確稱取脫氫乙酸標準品0.1000g(精確至0.0001g)于100mL容量瓶中,用10mL氫氧化鈉溶液(10.2.2)溶解,用水定容至刻度，備用)。

二、測定方法

(一)樣品的制備與提取。稱取均質后的樣品2g(精確至0.001g)，置于50mL離心管內，依次加入10mL甲醇和10mL水，超聲提取30min后，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液1mL和乙酸鋅溶液1mL，加水定容至25mL，4,000r/min離心5min，上清液過0.22μm濾膜過濾后，供高效液相色譜儀測定。

(二)色譜條件。色譜柱：C18(250mm×4.6mm,5.0μm)；紫外或二極管陣列檢測器；檢測波長：293nm；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃；流動相：1.甲醇+0.02mol/L乙酸銨(10+90)，2.甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)。

(三)試驗結果。

1.優化流動相。脫氫乙酸的羧基結構易于C18色譜柱中硅羥基結構發生反應，形成氫鍵，為此通過改變流動相的PH來確定合適的流動相及其比例，通過多次試驗，采用甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)作為此次優化試驗的流動相，對比國標GB5009.121-2016中的流動相，進行試驗如下。

吸取脫氫乙酸貯備液適量，至5mL容量瓶中，加水至刻度，配制成濃度為100μg/mL標準工作液，分別在流動相1——甲醇+0.02mol/L乙酸銨(10+90)；流動相2——甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)，兩種色譜條件下進行測定：以流動相1進行檢測，圖譜如圖1所示。

圖1

以流動相2進行檢測，圖譜如圖2所示。

圖2

通過譜圖1、2比對，流動相2：甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)，色譜峰拖尾明顯改善，故選用流動相2。

2.線性。分別吸取脫氫乙酸貯備液適量，至5mL容量瓶中，加水至刻度，配制成濃度為1.00μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL標準工作液，上機測定，相關系數為0.9998，線性方程為：y=35.47270x+34.45627。

圖3

3.精密度及回收率。取空白試樣36份，每6份加入同一濃度的脫氫乙酸標準儲備溶液，分別按照前處理及色譜條件(流動相2)進行測定，測定結果如表1所示。

表1

4.檢出限。稱取空白試樣3份，加入一定量的脫氫乙酸標準儲備溶液，使其濃度在0.002g/kg，按照優化好的前處理及其色譜條件進行測定，目標成分脫氫乙酸信噪比大于3，表明儀器滿足該方法檢出限0.002g/kg。

三、結語

本試驗在國標GB5009.121-2016的基礎上對樣品前處理及色譜條件進行了優化，將前處理過程簡單化，采用超聲提前樣品中目標成分，亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉淀蛋白質大分子物質；色譜條件中對流動相進行了調整，由原來的乙酸銨更改為磷酸水溶液。優化后的方法前處理過程更加簡單快捷，回收率90%以上，線性相關系數0.99987，重復性良好(RSD<0.6%)，方法檢出限為0.002g/kg,色譜峰拖尾明顯改善,可在某些食品檢測系統中推廣應用。