液相色譜-高分辨質譜結合蛋白質組學技術分析曲妥珠單抗耐藥胃癌細胞的轉錄因子

常晉霞 汪宜 張帆 劉文虎

摘?要?采用基于液相色譜-高分辨質譜的轉錄因子結合序列串聯多拷貝雙聯DNA結合元件（Concatenated tandem array of transcription factor response elements， catTFRE） Pull down蛋白質組學技術，研究了曲妥珠單抗耐藥胃癌細胞的轉錄因子及其調控作用。以合成的串聯轉錄因子結合序列DNA片段為親和試劑，用生物素標記，作為“DNA誘餌”，通過Pull down富集后，采用液相色譜-高分辨質譜檢測捕獲的轉錄因子，基于強度定量法（Intensity based absolute quantification， iBAQ）定量，篩選出與DNA結合活性顯著變化的轉錄因子。利用WebGestalt （2017）數據庫對激活轉錄因子調控的信號通路、家族分類、調控網絡及轉錄因子-靶基因（TFs-targets）進行分析。結果表明， 359個轉錄因子被定量檢測，與親本細胞相比，61個轉錄因子在曲妥珠單抗耐藥胃癌細胞中與DNA結合活性顯著變化，其中結合活性增強48個，活性降低13個。激活轉錄因子屬于bZIP、bHLH、homebox、HMG box、Zine finger等家族。KEGG通路富集顯示，癌癥、MAPK、Wnt、TGF-β、凋亡等多條通路在耐藥細胞中顯著改變。TFs-targets分析表明，TCF7L2、TCF7、FOXC1、JUN、CYC、FOS、ELK4、NFκB2、DDIT3和ATF2在上皮-間質轉化（Epithelial-mesenchymal transformation， EMT）、Wnt、MAPK信號通路促使胃癌曲妥珠單抗耐藥過程中發揮重要調控作用，提示靶向這些轉錄因子所調控的信號通路可能是逆轉胃癌曲妥珠單抗耐藥的重要途徑。

關鍵詞?曲妥珠單抗; 耐藥性; 轉錄因子結合序列串聯多拷貝雙聯DNA結合元件; Pull down; 蛋白質組學

1?引 言

胃癌的發病率、死亡率在所有惡性腫瘤中位居前列，由于缺乏早期診斷手段，超過70%的患者確診時已有轉移或進入中晚期[1]。曲妥珠單抗為靶向HER-2的單克隆抗體藥物，通過拮抗HER-2信號轉導及抗體依賴細胞介導的細胞毒作用發揮作用，用于HER-2過表達轉移性乳腺癌和胃癌的治療[2]。盡管曲妥珠單抗療效確切，然而腫瘤獲得性耐藥已成為影響其有效治療的重要問題[3]。因此，研究胃癌曲妥珠單抗耐藥機制，對闡明逆轉耐藥機理，增強腫瘤化療敏感性具有重要意義。

近年來，基于質譜的蛋白質組學高通量分析方法得到快速發展，為闡明疾病的發病機理提供了技術條件[4～6]。轉錄因子作為調控基因表達的蛋白質，在腫瘤增殖、轉移及耐藥過程中發揮著重要作用[7]。對轉錄因子的定量分析研究是闡明其生物功能、揭示轉錄調控機制的首要條件，然而由于轉錄因子的豐度極低，因此給其檢測和定量帶來了極大困難。盡管mRNA測序、染色質免疫共沉淀結合高通量測序（ChIP-Seq）等技術被用于轉錄因子在mRNA水平的定量及轉錄因子與DNA結合的動態研究，然而由于mRNA與蛋白質表達的相關性僅30%，因此以mRNA推測轉錄因子的表達的準確性并不高[8]; 而ChIP-Seq對抗體的特異性要求高，容易出現假陽性或假陰性結果[9]。Ding等[10]開發了一種深度檢測轉錄因子與DNA結合活性的技術，合成了包含100種不同類型轉錄因子結合序列的串聯多拷貝DNA結合元件，用生物素標記后包裝成“DNA誘餌”，采用Pull down策略富集核內轉錄因子，利用蛋白/肽段分級分離聯合質譜技術對捕獲的轉錄因子進行深度分析，解決了轉錄因子定量檢測的難題，為低豐度蛋白質的定量分析提供了新策略。

在本研究組的前期研究中[11，12]，基于蛋白質組學技術研究了曲妥珠單抗耐藥胃癌細胞蛋白質表達譜，發現多條信號通路激活與耐藥相關，在此基礎上探究了逆轉胃癌曲妥珠單抗耐藥的可能策略[13]。本研究以曲妥珠單抗敏感細胞NCI N87和耐藥細胞NCI N87/R為研究對象，利用基于質譜的蛋白質組學技術結合catTFRE pull down策略，從轉錄調控角度探究曲妥珠單抗耐藥胃癌細胞NCI N87/R的轉錄因子，通過生物信息學手段對激活轉錄因子調控的信號通路、作用網絡、家族分類及轉錄因子-靶基因調控關系進行分析，為胃癌曲妥珠單抗耐藥機制研究提供了科學依據。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Q-Exactive Plus質譜儀和Easy-nLC 1000 nano液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）; VCX500型SONICS多功能超聲儀（美國Sonics公司）; HS-3垂直混合儀（寧波新芝生物公司）; GL-802B微型真空泵（海門其林貝爾儀器公司）; 5810R型真空濃縮儀（德國Eppendorf公司）; DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器公司）; CKX31型光學顯微鏡（日本Olympus公司）; LRH-70生化培養箱（上海一恒科學儀器公司）。

NCI N87和NCI N87/R細胞由軍事醫學科學院施明教授惠贈。注射用曲妥珠單抗（上海羅氏制藥有限公司，規格440 mg，批號S20060026）; 胎牛血清（FBS， 美國Gibco公司）; DMEM培養基和胰酶（美國Mediatech公司）; 雙抗（含100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，北京鈕英泰克生物技術有限公司）; pGEX4T2-catTFRE重組質粒（上海Sigma公司合成）; Biotin標記的catTFRE引物（華大基因合成，引物5′用biotin標記，正向引物：5′-CCCAGTCACGTAGCGATAGC-3′，反向引物：3′-CGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAG-5′）; DNA聚合酶、DNA Ladder、DL2000 DNA ladder（日本TakaRa公司）; Pure Plasmid Mini Kit、Gel extraction kit、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（北京康為世紀生物有限公司）; NE-PER核蛋白提取試劑盒、DynabeadsTM M-280 Streptavidin親和磁珠（美國Thermo Fisher公司）; 胰酶（美國Promega公司）; 抗體c-Jun（9165）、JunB （3753）、c-Myc（5605）和GAPDH（5174） （美國Cell Signaling Technology公司）; NaHCO3、NaOH（分析純，美國Sigma公司）; 甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、純水（HPLC級，美國Thermo Fisher公司）; NETN、BC-0、2×DNA Binding Buffer、1×DNA Binding Buffer、BC-150、BC-200、50×TAE和Destain脫色液（自制）。

2.2?實驗方法

2.2.1?細胞培養?親代細胞NCI N87和耐藥細胞NCI N87/R采用DMEM （加10% FBS和1%雙抗）培養基， 在5% CO2、37℃培養箱中培養，細胞傳代2～3次后進行實驗。為保持耐藥性質，NCI N87/R細胞培養過程需加入一定量的曲妥珠單抗，終濃度為40 μg/mL。

2.2.2?重組質粒pGEX4T2-catTFRE的提取?catTFRE序列根據高等脊椎動物轉錄因子庫設計（http：//jaspar.genereg.net/），將其鏈接到pGEX4T2載體上，得到全長為2.8 kb的重組質粒。將1 μL pGEX4T2-catTFRE質粒加入到50 μL TOP10感受態細胞中，經熱激、復蘇后涂布于氨芐抗性Luria-Bertani平板，37℃培養過夜，取單菌落接種于2 mL Luria-Bertani培養液，培養6 h，按1∶100接種至50 mL培養基， 培養18 h，按試劑盒說明提取質粒。

2.2.3?Biotin標記catTFRE DNA擴增?引物序列見2.1節，PCR反應體系及條件詳見文獻[8]。DNA序列見電子版文后支持信息。

2.2.4?Biotin標記catTFRE DNA的純化與回收?catTFRE DNA經瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，使用DNA凝膠試劑盒回收、純化，測定濃度后分裝，20℃保存，備用。

2.2.5?核蛋白提取[10] 收集對數期生長的細胞，用預冷PBS清洗2次，重懸，800 r/min離心5 min，棄上清液。利用NE-PER試劑盒提取核蛋白，加入CERI和蛋白酶抑制劑，振蕩，冰上裂解15 min。加入適量CERII，振蕩10 s，冰上裂解30 s，4℃、16000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入NER重懸，振蕩20 s，4℃垂直混勻儀孵育1 h。4℃、16000 r/min離心20 min，將核蛋白提取物轉移于EP管中，用Bradford法測定蛋白濃度。

2.2.6?catTFRE pull down[10] 取DynabeadsTM M-280 Streptavidin適量于EP管中，加入300 μL1×DNA結合緩沖液清洗M-280，加入計算量的catTFRE DNA（120 μL M-280結合3 pmol/L catTFRE DNA），再加入等量2×DNA結合緩沖液，4℃垂直混勻儀孵育20 min。用200 μL BC-200清洗M-280，加入核蛋白，用BC-0調整鹽濃度至200 mmol/L，4℃孵育2 h，分別用50 mmol/L NETN和PBS清洗M-280。

2.2.7?SDS-PAGE凝膠電泳?樣品中加入20 μL上樣緩沖液，混勻，95℃金屬浴煮5 min，取上清液，進行SDS-PAGE電泳[10]，待Marker進入分離膠約2.0 cm停止電泳，用考馬斯亮藍染色。將膠條自下而上橫切成6等份，分別置于EP管中，加入500 μL Destain脫色液，振蕩至完全脫色，加入200 μL 75%乙腈，振蕩30 min，吸去脫色液; 加入質譜水500 μL，振蕩水化1 h，加入50 mmol/L NH4HCO3 300 μL，振蕩5 min，吸去上清液，加入100 ng/μL胰酶-50 mmol/L NH4HCO3（1∶10，V/V）溶液，搗碎膠條，37℃孵育過夜，肽段消化后用200 μL乙腈萃取2次，合并萃取液，12000 r/min離心5 min，加入30 μL 0.1%甲酸，振蕩5 min，再加入200 μL乙腈，振蕩5 min，合并上清液，60℃真空抽干，質譜檢測。

2.3?色譜及質譜條件

2.3.1?色譜條件?反相C18分離柱（2 cm×100 μm×3 μm，美國Thermo Fisher公司）; 反相C18分析柱（15 cm×75 μm×3 μm， 尖端開口5～10 μm， 美國Thermo Fisher公司）; 液相色譜分離條件為： 流動相A為0.1%（V/V）甲酸， 流動相B為0.1%甲酸-80%（V/V）乙腈， 梯度洗脫： 0～14 min， 8%～12% B; 14～51 min， 12%～27% B; 51～68 min， 27%～40% B; 68～69 min， 40%～100% B; 69～75 min， 100% B; 流速為350 nL/min。

2.3.2?質譜條件?納升級電噴霧離子源（Nanoelectrospray ionization）， 離子源電壓為2.0 kV， 母離子、子離子使用靜態軌道阱（Orbitrap）檢測; 一級掃描質荷比（m/z）為300～1500， 分辨率為70000， 掃描模式為Top-speed， 一級掃描的自動增益控制（Automatic gain control， AGC）為3000000， 最大注入時間為60 ms; 二級掃描范圍自動設置， 分辨率為15000。離子隔離窗口為3 Th， 采用37%的能量進行高能碰撞解離（High-energy collisional dissocation， HCD）， 二級掃描的AGC為50000， 最大離子注入時間（Maximum ion injection time）為80 ms， 離子掃描電荷數為+2～+6， 排除同位素干擾峰， 動態排除時間為18 s。

2.4?質譜鑒定及數據分析

樣品用0.1%甲酸復溶， 12000 r/min離心10 min，取上清液，用Easy-nLC 1000 nano液相色譜-Q Exactive Plus質譜進行檢測，使用搭載Mascot 2.3搜索引擎的Proteome Discover 2.1（美國Thermo Fisher公司）進行搜庫，數據庫為人類生物技術信息中心蛋白質庫（更新至04/07/2013，包含蛋白質數目為32015個）。母離子的質量公差（Mass tolerances）為20 ppm，子離子為0.5 Da; 允許胰酶漏切位點數≤2; 肽段長度為7～25個氨基酸; 蛋白質動態修飾為phosphor（Y）、phosohor（ST）、de Streak（C）、acetyl（protein N-term）、oxidation（M）。采用Percolator進行正反庫搜索，控制肽段水平的假陽性率（FDR）<1%。

基于數據依賴性模式（Data dependent acquisition， DDA）采集數據。采用iBAQ方法對鑒定的蛋白質進行定量[14]，其基本原理為每個蛋白質鑒定到的全部肽段曲線下的面積之和（AUCs）與此蛋白的理論酶切肽段數（N）之比為此蛋白的表達量（AUCs/N）。用FOT（Fraction of total）代表蛋白質標準化后的峰面積[15]，即每個蛋白質的iBAQ除以樣本中所有蛋白質的iBAQ （FOT=iBAQ/∑iBAQ）。為了計算方便，將鑒定到的所有蛋白質的FOT乘以105得到iFOT5。肽段篩選標準為： 每個蛋白質被檢測的特異肽段數≥1，且Mascot ions scores≥20。數據分析采用兩樣本獨立t檢驗，若某轉錄因子與DNA結合活性在親代和耐藥細胞中的比值大于1.5倍，且滿足P<0.05，則認為該轉錄因子與DNA的結合能力增強，或轉錄因子表達量增加引起與DNA的結合能力增強，反之亦然。

2.5?Western blot檢測相關蛋白質的表達

參照文獻[15]提取NCI N87和NCI N87/R細胞核蛋白，進行western blot實驗，抗體c-Jun、c-Myc、JunB和GAPDH稀釋倍數為1∶1000，二抗稀釋倍數為1：3000。目標蛋白經曝光后掃描圖像，采用Image J進行灰度值檢測并分析。

3?結果與討論

3.1?pGEX4T2-catTFRE重組質粒的提取與純化

參照文獻[10]進行重組質粒pGEX4T2-catTFRE DNA提取與純化。結果顯示，在2.8 kb位置可見清晰且無干擾的目的條帶（圖1），與DL2000 DNA marker相比，提取質粒濃度≥100 ng/μL，濃度及純度均符合實驗要求。

3.2?catTFRE pull down實驗

為檢測和定量分析曲妥珠單抗耐藥胃癌細胞轉錄因子，分別提取NCI N87和NCI N87/R細胞核蛋白，利用液相色譜-質譜結合catTFRE pull down的蛋白質組學技術對轉錄因子進行檢測和定量分析，采用生物信息學技術分析與DNA的結合活性顯著變化的轉錄因子（圖2）。

3.3?質譜數據質控分析

對NCI N87和NCI N87/R樣本分別進行3次生物學重復實驗，基于Spearman方法進行相關性分析。每組中各個樣本的相關系數r>0.85（圖3），表明實驗重復性良好。

3.4?激活轉錄因子的篩選與分析

從肽段水平設置1% FDR，共鑒定得到轉錄因子359個。為明確數據分布，對NCI N87/R和NCI N87樣本的所有蛋白質的變化倍數（Fold change）進行總體分析，以NCI N87/R與NCI N87 3次生物學重復樣本中蛋白質峰面積均值之比作為變化倍數，再進行對數轉化，發現90%以上的蛋白質在NCI N87/R/NCI N87中的變化倍數介于1.5倍范圍內，不足10%的蛋白質豐度變化較大（這些蛋白質具有較小的iFOT （iFOT<1）），總體數據符合正態分布（圖4A）。因此，兩組樣本的均值滿足獨立樣本t檢驗分析。根據顯著性水平及均值的變化倍數繪制餅圖，若某轉錄因子在3次重復實驗的均值在兩組樣本中的比值大于1.5，即轉錄因子與DNA結合活性或其表達量變化≥1.5倍（Fold change≥1.5）且p<0.05， 則認為該轉錄因子在耐藥細胞中被激活，其中Fold change（NCI N87/R/NCI N87）≥1.5且p<0.05表示轉錄因子與DNA的結合活性增強或表達量增加; Fold change（NCI N87/R/NCI N87）≤0.67且p<0.05表示與DNA的結合活性減弱或表達量降低。結果表明，61個轉錄因子與DNA結合活性在耐藥細胞中發生了顯著改變（電子版文后支持信息表S1），其中活性增強48個，活性減弱13個，活性未顯著改變298個（圖4B）。為更加直觀顯示轉錄因子的表達水平及其關系，依據生物學功能進行雙邊聚類分析，結果以熱圖形式可視化展示（圖4C）。聚類關系為層次聚類，測量方法為歐式距離法，聚類算法為均值，方塊顏色代表轉錄因子的表達水平，紅色代表轉錄因子的表達量增加或與DNA的結合能力增強，綠色代表轉錄因子的表達量降低或與DNA的結合能力減弱（圖4C）。

3.5?Western blot分析部分激活轉錄因子的表達水平

基于Western blot檢測了c-Jun、c-Myc、JunB在NCI N87和NCI N87/R細胞中的表達水平，以進一步探究NCI N87/R細胞中轉錄因子激活的可能原因。檢測結果表明，盡管c-Jun、c-Myc和JunB在NCI N87/R中的表達量有變化，但與NCI N87細胞相比，其表達差異無統計學意義（p值分別為0.11、0.50和0.43），提示耐藥細胞轉錄因子激活可能由DNA結合活性的改變引起（圖5）。

3.6?激活轉錄因子調控信號通路分析

利用STRING （https：//string-db.org/）數據庫對相互作用得分>0.7（高可信度）的轉錄因子進行網絡構建，進一步基于WebGestalt數據庫（http：//www.webgestalt.org）中KEGG模塊進行通路富集分析，利用Cytoscape（v.3.6.0）軟件對富集結果進行可視化展示。篩選出顯著性水平p<1×103的信號通路有10條，分別是癌癥（p=1.33×106）、MAPK（p=4.16×105）、Wnt（p=7.34 ×105）、TGF-β（p=2.60 ×105）、凋亡（p=1.26 ×104）、DNA損傷（p =1.53 ×103）、PDGF（p=2.85×103）、白介素信號（p =4.72 ×103）、氧化應激反應（p=6.62 ×103）及Toll受體信號通路（p=7.48×103） （電子版文后支持信息圖S1）。可以明顯看出，在富集的所有通路中，癌癥、MAPK、Wnt、TGF-β及凋亡信號通路具有較小的p值（定量結果見圖6）。

MAPK、Wnt信號在腫瘤轉化、耐藥過程中相互影響，二者共同作用于GSK-3β，通過上調snail水平，降低E-cadherin表達，誘導腫瘤細胞EMT發生[16]。前期研究中[11，12]，已經證實MAPK、Wnt信號激活貢獻胃癌曲妥珠單抗耐藥，但對激活信號通路的促動因子尚未闡明。本研究發現，TCF7L2、TCF7、JUN、MYC、FOXC1、FOS、DDIT3、ELK4、NFκB2、AFT2在激活MAPK、Wnt通路中發揮重要的調控作用; 此外，本研究還發現了調控TGF-β、凋亡通路的轉錄因子，這些結果為進一步闡明胃癌曲妥珠單抗耐藥機制奠定了基礎。

3.7?激活轉錄因子家族分類

對轉錄因子進行分類研究是了解其生物功能的重要途徑。本研究中鑒定得到的轉錄因子覆蓋了DBD數據庫（www.transcriptionfactor.org）中注釋的80%以上的轉錄因子家族，包括bZIP、bHLH、homeobox、HMG box、Hormone受體、GATA、Zine finger、ETS等（電子版文后支持信息圖S2）。這些轉錄因子具有信號轉導調控、轉錄調控、細胞周期調控、代謝、發育、癌癥發生與轉移等多種生物學功能[7，17～19]。其中，ATF家族、TEF、NFIL3、JUN、JUNB、XBP1、DDIT3、FOSL1和FOS屬于bZIP家族，CUX1、PBX3、DLX3、HOXA4、HOXA3、MEIS1、PBX1和BARX1包含homebox結構域，而FOXP1、ZNF740、ZNF282、KLF4和OVOL2歸屬于鋅指蛋白家族。TCF7、TCF7L2、FOXC1、JUN及MYC在腫瘤EMT誘導耐藥過程中發揮著重要作用[15，20，21]。

3.8?激活轉錄因子網絡分析

為進一步明確激活轉錄因子之間的互作關系，進而了解與曲妥珠單抗耐藥相關的轉錄因子，對激活轉錄因子之間的調控關系進行了分析。結果發現，整個網絡以JUN和FOS為節點中心構成網絡“骨架”，其它轉錄因子分別以此為中心構成下游網絡鄰居，其中JUN在整個網絡中起正向調控作用，FOS起負向調控作用（圖7A），以及由轉錄因子TCF7、TCF7L2、FOXC1、JUN和MYC組成的子網絡（圖7B），它們在腫瘤EMT過程中發揮重要調控作用。如TCF7L2與TCF7作為TCF/LEF家族成員，形成二聚體參與調控HMG box結合以及EMT、癌癥的轉移[22]，而且TCF7、TCF7L2和FOXC1也是Wnt通路的主要效應分子[23～25]; 由FOS、JUN、MYC和ATF2等構成的子網絡在MAPK通路中發揮重要調控作用（圖7C）[26～28]。

3.9?激活轉錄因子-靶基因分析

基于CellNet轉錄因子-靶基因數據庫（http：//cellnet.hms.harvard.edu）構建了轉錄因子-靶基因調控網絡[29]。將激活轉錄因子與蛋白質表達譜中的差異性表達蛋白質對接繪制網絡圖（圖8）（全蛋白質表達譜數據見文獻[11]），整個網絡包括3個EMT-TFs調控模塊，每個模塊以TCF7L2、TCF7和FOXC1為效應分子進行網絡構建，主要發揮對靶基因的正向調控作用; 此外，以CASP8為中心構成了負向調控網絡， CASP8被轉錄因子TCF7L2、TCF7和FOXC1共同抑制，發揮負向調控作用。總體上，在耐藥細胞NCI N87/R中，TCF7L2、TCF7和FOXC1對EMT相關靶基因起正向調控作用，而對凋亡信號起負向調控作用。CASP8是細胞重要的凋亡分子，直接參與凋亡啟動和凋亡信號的活化過程，以及腫瘤的分化、轉移等[30]。TCF7L2、TCF7和FOXC1負向調控CASP8的表達，導致耐藥細胞抗凋亡能力進一步增強。綜上，轉錄因子-DNA結合活性變化與蛋白質表達譜的結果相吻合，即胃癌細胞對曲妥珠單抗耐藥與EMT、Wnt、凋亡等多條信號通路的激活有關，提示針對這些轉錄因子所調控的信號通路可能是逆轉耐藥的有效途徑。

4?結 論

本研究基于液相色譜-高分辨質譜結合catTFRE pull down蛋白質組學技術，檢測并定量分析了NCI N87和NCI N87/R細胞的轉錄因子，從轉錄調控角度分析了轉錄因子驅動NCI N87細胞對曲妥珠單抗耐藥的可能機制，并通過生物信息學手段分析了激活轉錄因子調控的信號通路，構建了其調控關系，探究了轉錄因子-靶基因的調控作用，闡釋了EMT、Wnt、MAPK、凋亡等通路激活貢獻胃癌細胞對曲妥珠單抗的耐藥性，分析了調控EMT、Wnt和MAPK通路的多個靶基因。本研究為胃癌曲妥珠單抗耐藥機制研究提供了依據，也為逆轉其耐藥治療提供了參考。

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