重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001的臨床前主要藥效學研究

王羅春 瞿愛東 樓麗廣

摘 要 目的：評估重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001的臨床前主要藥效學及與原研藥安維汀的生物類似性。方法：從體外作用機制及活性、體內抑瘤作用、及對荷瘤小鼠PK/PD等方面進行研究。結果：F0001明顯抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化；抑制HUVEC細胞增殖，IC50為123 ng/ml。F0001 5 mg/kg顯著抑制人結腸癌Ls-174t、肺癌NCI-H460和惡性膠質瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤生長，抑瘤率分別為68%、68%和86%；與化療藥CPT-11合用對人結腸癌Ls-174t有抑瘤增效作用，抑瘤率提高到89%。F0001與安維汀體外作用機制及活性相當、體內抑瘤效果相當，二者在人結腸癌Ls-174t荷瘤小鼠體內PK/PD參數相似。結論：F0001與原研藥安維汀在主要藥效學方面高度類似。

關鍵詞 重組抗VEGF人源化單克隆抗體 安維汀 抑瘤率

中圖分類號：R965； R979.19 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）13-0055-06

Preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001*

WANG Luochun1**， QU Aidong2***， LOU Liguang3****（1. Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Shanghai Institute of Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200051， China； 3. Shanghai Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the preclinical pharmacology of recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody F0001 and its biological similarity to the original drug Avastin. Methods： F0001 was evaluated for its mechanism of action， antitumor activity in vitro and in vivo， and PK/PD in tumor-bearing nude mice. Results： F0001 could significantly inhibit VEGF-stimulated KDR and downstream factor ERK1/2 phosphorylation， and VEGF-stimulated HUVEC proliferation with IC50 of 123 ng/ml. F0001 at 5 mg/kg could significantly inhibit the growth of human colon cancer Ls-174t， lung cancer NCI-H460 and malignant glioma U-87MG tumors subcutaneously transplanted into nude mice with the tumor inhibition rate of 68%， 68% and 86%， respectively. Combination of F0001 with chemotherapy drug CPT-11 produced synergistic antitumor effect in Ls-174 xenografts with the tumor growth inhibition of 89%. Conclusion： The mechanism and activity of F0001 in vitro and in vivo are similar to Avastin and their PK/PD parameters are similar in human colon cancer Ls-174t tumor-bearing mice. The main preclinical pharmacology of F0001 is very similar to that of original drug Avastin.

KEy WORDS recombinant anti-VEGF humanized monoclonal antibody； Avastin； tumor inhibition rate

安維汀（貝伐珠單抗注射液， Avastin）是美國基因技術公司和羅氏制藥公司開發的一種抗人血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的人源化單克隆抗體藥物，與化療藥合用，用于治療轉移性結直腸癌、非小細胞肺癌、轉移性腎細胞癌、腦膠質瘤、晚期子宮頸癌、鉑耐藥復發性卵巢癌、轉移性Her2陰性乳腺癌等[1-2]；2010年2月也獲準在我國上市，用于治療轉移性結直腸癌及非小細胞肺癌[3]。因此，安維汀是一種廣譜性抗癌藥物，臨床價值巨大。但其價格高昂，極大地限制了在我國臨床使用的可及性。

復旦張江公司研制的重組抗VEGF人源化單克隆抗體F0001是安維汀的生物類似候選藥物。本研究從F0001的體外作用機制及活性、體內對裸小鼠荷人結腸癌Ls-174t或肺癌NCI-H460或惡性膠質瘤U-87MG的抑瘤活性、以及在荷瘤裸小鼠的體內代謝動力學（pharmacokinetics based on pharmacodynamic drug concentration，PK/PD）等方面[4-7]，研究了F0001的臨床前主要藥效學作用及其與原研藥安維汀的生物類似性，以便為本品臨床研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試藥物

重組抗VEGF人源化單克隆抗體（簡稱F0001）注射液（上海復旦張江生物醫藥股份有限公司研制，批號20140701）；安維汀（Roche Pharma （Schweiz） Ltd.，批號H0125B03、 H0132B04，使用前將供試藥用培養液或含0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的生理鹽水稀釋至適當濃度，置2～8 ℃冰箱保存備用）；鹽酸伊立替康（CPT-11）（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號616130304，使用時用生理鹽水配制。

1.2 試劑、儀器及細胞株

胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；培養基M199/RPMI 1640購自Gibco BRL公司；VEGF165購自R&D Systems公司；phospho-ERK1/2 antibody及ERK1/2 antibody購自Cell Signaling Technology公司；b-tubulin antibody購自Sigma公司；抗兔IgG二抗，抗小鼠IgG二抗購自Calbiochem公司；PVDF膜及ECL檢測試劑盒購自Millipore公司；磺酰羅丹明B（SRB）購自Sigma公司；Synergy H4多功能酶標儀購自BioTek公司。

人臍靜脈血管內皮細胞株（HUVEC）（美國ATCC，用含20 mg/ml ECGS、20% FBS的M199培養2～6代進行實驗）；人結腸癌Ls-174t細胞株/肺癌NCI-H460細胞株/惡性膠質瘤U-87MG細胞株均購自美國ATCC，均用含有青霉素、鏈霉素、及10% FBS的RPMI 1640培養。

1.3 實驗動物

BALB/cA裸小鼠，雌性，6～7周，分別購自上海靈暢生物科技有限公司，合格證號2013001801920、2013001804063；上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號2007000572618、2007000571898、2007000-573259。

1.4 試驗方法

1）對VEGF刺激的VEGFR2/KDR信號作用（Western blot法）[4，8] HUVEC接種于六孔板中，將不同濃度（0.001～10 mg/ml）F0001或安維汀與50 ng/ml VEGF預孵育30 min，再作用于HUVEC 5 min，然后收集細胞裂解。細胞裂解物在沸水浴中加熱變性。取上清液進行SDS-PAGE電泳，而后用濕轉系統將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，將膜置于一抗溶液中溫育，再用含TBS/T洗滌。將膜置于二抗溶液中室溫反應1 h；同上洗膜三次后，用ECL試劑發色、顯影。

2）對HUVEC細胞增殖生長的抑制作用（SRB法）[4，9] 接種一定數量對數生長期HUVEC于96孔培養板，貼壁生長24 h，將不同濃度（0.3～3 000 ng/ml）F0001或安維汀與40 ng/ml VEGF預孵育30 min，再作用于HUVEC。每濃度設復孔，同時設相應濃度溶媒對照。然后將HUVEC于37 ℃、5% CO2條件培養72 h。SRB染色，加入CCK-8溶液，37 ℃放置4 h。用酶標儀于450 nm波長下測定OD值，應用公式：抑制率 =（對照孔細胞OD值-給藥孔細胞OD值）/對照孔細胞OD值×100%，計算細胞生長抑制率及半數抑制濃度IC50。

3）對裸小鼠皮下移植瘤的療效[4，7] 裸小鼠分別皮下接種人結腸癌Ls-174t細胞或人肺癌NCI-H460細胞或人惡性膠質瘤U-87MG細胞，待腫瘤生長至100～150 mm3后，將各類荷瘤動物分別隨機分組后給藥（D0），給藥劑量和給藥方案見表1。每周測瘤體大小2～3次，稱鼠重，記錄數據，計算腫瘤體積及抑瘤率。

腫瘤體積（V）計算公式：V=1/2×a×b2，其中 a、b分別表示瘤長、瘤寬；

根據測量結果計算相對腫瘤體積（RTV），RTV=Vt/V0，其中V0為分籠給藥時（即D0）所測得的腫瘤體積，Vt為每次測量時的腫瘤體積。

應用公式T/C（%）=（T-T0）/（C-C0）×100%，計算抑瘤率；抑瘤率（%）=100%-T/C（%）。其中T、C為實驗結束時給藥組、生理鹽水組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時給藥組、生理鹽水組的腫瘤體積。

當腫瘤出現消退時，抑瘤率（%）=100%-（T- T0）/T0×100%。如果腫瘤比起始體積縮小，即T

4）對裸小鼠的代謝動力學[4，10] 裸小鼠皮下接種人結腸癌Ls-174t細胞，待腫瘤生長至200～300 mm3后，將動物隨機分組，分別單次靜脈注射F0001或安維汀1.5和5 mg/kg，給藥后5 min、4 h、24 h，48 h、72 h、96 h、168 h，各取4只小鼠，眼眶采集全血，凝血后離心采集血清；同時取腫瘤組織。血清、腫瘤組織于-80 ℃保存，最終檢測藥物濃度。

2 結果與分析

2.1 對VEGF刺激的VEGFR2/KDR信號的抑制作用

如圖1所示，VEGF顯著誘導高表達KDR的HUVEC細胞中的KDR磷酸化（左起，第2列）；F0001在1 mg/mL能明顯抑制VEGF刺激的KDR磷酸化及下游因子ERK1/2磷酸化，其抑制活性與參比抗體安維汀相當。

注：左起第2列顯示，VEGF誘導HUVEC細胞的KDR信號通路磷酸化，即P-KDR條帶變深；以及其下游信號ERK1/2的磷酸化，即P- ERK1/2條帶變深。隨著F0001劑量的增加（左起第3～7列），由于其對VEGF的中和抑制作用，VEGF誘導的磷酸化效應逐步減弱，即P-KDR、P- ERK1/2條帶逐步變淡，比較明顯的效應劑量是從1 mg/ml起

2.2 對HUVEC細胞增殖生長的抑制作用

F0001可顯著抑制VEGF刺激的HUVEC細胞增殖，其IC50為123 ng/ml，與安維汀（IC50 = 122 ng/ml）相當（圖2）。

2.3 對裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用

F0001或安維汀對裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤效果見表2。

1） F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明顯抑制人結腸癌Ls- 174t裸小鼠皮下移植瘤的生長，抑瘤率分別為40%、47%和68%；安維汀 1.5/5 mg/kg對Ls-174t的抑瘤率分別為46%和63%。荷瘤小鼠對兩藥物均能很好耐受，沒有體重下降等癥狀發生。總體比較，二者對Ls-174t裸小鼠皮下移植瘤療效相當。

2） CPT-11 6 mg/kg對Ls-174t的抑瘤率為60%；F0001或安維汀與CPT-11合用，療效顯著增強，抑瘤率分別從單藥的69%和68%提高到89%和89%。CPT-11單用使荷瘤小鼠體重下降，但與F0001或安維汀合用小鼠狀態有所改善，體重回升。總體比較，無論是單用還是與CPT-11合用，F0001和安維汀對結腸癌Ls-174t的療效相當。

3） F0001 0.5/1.5/5 mg/kg可明顯抑制人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤的生長，抑瘤率分別為53%、62%和68%；安維汀 1.5/5 mg/kg對NCI-H460的抑瘤率分別為57%和61%。荷瘤小鼠對兩藥物均能很好耐受，沒有體重下降等癥狀發生。總體比較，二者對NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤療效相當。

4） F0001 1.5/5 mg/kg可明顯抑制人惡性膠質瘤U-87MG裸小鼠皮下移植瘤的生長，抑瘤率分別為74%和86%；安維汀 1.5/5 mg/kg對U-87MG的抑瘤率分別為64%和83%。荷瘤小鼠對兩藥物均能很好耐受，沒有體重下降等癥狀發生。總體比較，二者對U-87MG裸小鼠皮下移植瘤療效相當。

2.4 對裸小鼠的代謝動力學

人結腸癌Ls-174t荷瘤裸小鼠單次靜脈注射F0001或安維汀 1.5/5.0 mg/kg后，血清藥物峰濃度時間Tmax均相同；同等劑量下，血清藥物濃度C0值和血清藥物暴露水平AUC0-t都比較接近，提示F0001與安維汀在荷瘤鼠中的血清藥代過程相似。

在腫瘤組織中，F0001或安維汀 5.0 mg/kg單次注射后的達峰時間Tmax、峰濃度Cmax、藥物暴露水平AUC0-t都比較一致。總體結果提示，二者在荷瘤裸小鼠體內的代謝動力學（PK/PD）過程相似。

3 討論

早期我們從體外作用機制及活性、體內對裸小鼠荷人結腸癌Ls-174t（包括單藥及與化療藥合用）、肺癌NCI-H460、惡性膠質瘤U-87MG的抑瘤活性等方面研究了F0001的臨床前主要藥效學，隨著我國《生物類似藥研發與評價技術指導原則（試行）》的出臺[11]，我們結合本品藥代動力學（PK）試驗（另行試驗研究）補充進行了本品在荷瘤裸小鼠的體內代謝動力學（PK/PD）的試驗研究。

試驗中由于試劑、耗材、及96孔板細胞復孔的均一性等原因，部分單孔OD值數據出現反跳現象，但不影響F0001隨濃度增加對VEGF的抑制作用。后續本品生產中活性檢測的質控將得到優化。

F0001與安維汀在荷人結腸癌Ls-174t裸小鼠中的血清藥代過程相似，高劑量（5.0 mg/kg）時二者在腫瘤組織中的暴露水平也一致。但是，在低劑量（1.5 mg/kg）時二者在腫瘤組織中的暴露水平有差異，AUC0-t分別為4.24和13.71 h·mg/ml，分析其原因主要是受試品在腫瘤組織中48 h后的濃度已均低于定量下限。

總體而言，F0001與安維汀體外作用機制及活性相當、體內抑瘤效果相當，二者在人結腸癌Ls-174t荷瘤小鼠體內PK/PD參數相似；F0001與原研藥安維汀在主要藥效學方面高度類似。

參考文獻

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