HPLC法同時測定麒麟丸中的3種成分

李燕 吝佩 綦曉龍

摘 要 目的：建立HPLC法同時測定麒麟丸（制何首烏、墨旱蓮、淫羊藿等）中3種成分的含量。方法：麒麟丸50%乙醇提取液的分析采用Vensuil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以含0.05%三氟乙酸的水溶液（A）和含0.05%三氟乙酸的乙腈溶液（B）為流動相，梯度洗脫；體積流量1.2 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm。結果：橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷分別在6～18 mg/ml（r=0.999 8），3～9 mg/ml（r=0.999 8），2～6 mg/ml（r=0.999 9）范圍內線性關系良好，平均加樣回收率分別為95.9%、93.6%、92.4%，RSD分別為1.6%、3.0%、4.6%。結論：該方法準確、重復性好，可用于質量控制。

關鍵詞 麒麟丸 橙皮苷 丹酚酸B 淫羊藿苷 HPLC

中圖分類號：O657.72； R286 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）13-0061-04

Simultaneous determination of three constituents in Qilin pills by HPLC*

LI Yan1**， LIN Pei2， QI Xiaolong2（1. Shanghai Jinpibao Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200080， China； 2. Shanghai AppTec R&D Co.， Ltd.， Shanghai 200131， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the contents of three constituents in Qilin pills （ Polygoni Multiflori Radix Praeparata， Ecliptae Herba， Epimedii Folium）. Methods： The analysis of 50% ethanol extract of Qilin pills was performed on a Vensuil XBP C18 （ 4.6 mm×250 mm， 5 mm） by gradient elution with the mobile phase comprising of acetonitrile-0.05% trifluoroacetic acid at volume flow 1.2 ml/min， 30 ℃ and detection wavelength 220 nm. Results： Hesperidin， salvianolic acid B and icariin showed good linear relationship in the ranges of 6-18 mg/ml （r=0.999 8），3-9 mg/ml （r=0.999 8），2-6 mg/ml （r=0.999 9） with average recoveries of 95.9%， 93.6% and 92.4% and RSDs of 1.6%， 3.0% and 4.6%， respectively. Conclusion： This method is accurate and reproducible and can be used for the quality control of Qilin pills.

KEy WORDS Qilin pills， hesperidin； salvianolic acid B； icariin； HPLC

麒麟丸由制何首烏、墨旱蓮、淫羊藿、菟絲子、鎖陽、黨參、郁金、枸杞子、覆盆子、山藥、丹參、黃芪、白芍、青皮、桑椹等15味中藥組成，能夠補腎填精，益氣養血。適用于腎虛精虧，血氣不足，腰膝酸軟，倦怠乏力，面色不華，男子精液清稀，陽痿早泄，女子月經不調，或男子不育癥，女子不孕癥見有上述證候者[1]。目前，該質量標準設立了制何首烏中大黃素含量的薄層色譜掃描法作為含量測定項，文獻中也僅有報道制何首烏中二苯乙烯苷的含量測定方法[2-4]，對該組方中其它成分的含量測定方法未見報道。該方中青皮具有疏肝理氣、消積化滯的功效，其主要活性成分為黃酮類成分，現代藥理學研究表明橙皮苷具有抗氧化和延緩衰老的作用[5-6]；丹參具有活血化瘀，通經止痛的功效，用于胸痹心痛，癥瘕積聚，月經不調等。其主要活性成分為丹參酮和丹酚酸類組分。其中丹酚酸B具有抗氧化、防治動脈粥樣硬化等作用[7-8]；淫羊藿具有補腎陽，強筋骨的功效，用于腎陽虛衰，陽痿遺精，筋骨痿軟；淫羊藿總黃酮為其主要活性成分，其中淫羊藿苷具有增強免疫力，抗氧化和抗衰老的藥理作用[9-11]。因此，本實驗選擇橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷為指標成分，建立HPLC方法同時測定上述3種成分的含量，為其質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；HZQ-50H加熱回旋振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5810R離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

橙皮苷購自百靈威科技（批號L190Q57，純度98.1%）；丹酚酸B購自成都普瑞法科技開發有限公司（批號PRF7060803，純度98.3%）；淫羊藿苷購自南京景竹生物科技有限公司（批號JZ16121109，純度98.7%）；麒麟丸來自廣東太安堂藥業股份有限公司（批號A20161101、B20180807和B20180809，60 g/瓶）；乙腈、三氟乙酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備

取麒麟丸適量研細，精密稱取2 g，至100 ml具塞錐形瓶中，加入50%乙醇溶液50 ml，稱定重量，37 ℃振搖30 min，再超聲30 min，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，過0.45 mm聚四氟乙烯濾膜，取續濾液，即得。

1.3.2 對照品溶液制備

取橙皮苷對照品30 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，精密加入1 ml二甲基亞砜使溶解，然后加入50%乙醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，作為橙皮苷的對照品溶液；稱取16 mg丹酚酸B，置于100 ml量瓶中，加入50%乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，作為丹酚酸B的對照品溶液；精密稱取10 mg淫羊藿苷，置于100 ml量瓶中，加入50%乙醇稀釋并定容至刻度，作為淫羊藿苷的對照品溶液；精密吸取上述各對照品溶液各5 ml置于100 ml量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，搖勻，制成每1 ml含橙皮苷15 mg、丹酚酸B 8 mg、淫羊藿苷5 mg的混合對照品溶液；精密吸取2、3、4、5和6 ml至10 ml量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，即得系列濃度的混合對照品溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Vensuil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流動相A為含0.05%三氟乙酸的水溶液、B為含0.05%三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫（0～48 min，90%A→70%A；48～55 min，70%A→5%A）；體積流量1.2 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進樣量10 ml。

2 結果

2.1 系統適用性

將對照品和供試品溶液分別進樣測試，理論塔板數均>5 000，各峰與相鄰峰的分離度>1.5（圖1）。

2.2 線性關系考察

以峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度（mg/ml）為橫坐標（X），繪制標準曲線，各成分在各自濃度范圍內線性關系良好（表1）。

2.3 精密度試驗

同一供試品溶液連續進樣6次進行測定，計算橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷色譜峰的峰面積，RSD分別為0.8%、1.5%和1.1%，表明儀器的精密度良好。

2.4 重復性試驗

精密稱取同一供試品（批號A20161101）粉末2.0 g，共6份，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，HPLC測定并計算得橙皮苷、丹酚酸B、淫羊藿苷的RSD分別為0.8%、1.5%、1.1%，表明該方法重復性良好。

2.5 穩定性試驗

取供試品溶液于0、20、50、90 h進樣測定，測得橙皮苷、丹酚酸B、淫羊藿苷峰面積RSD分別為0.6%、1.2%、0.7%，說明供試品溶液在90 h內穩定性良好。

2.6 加樣回收率試驗

精密稱取含有量已知的供試品（批號A20161101）粉末0.8 g、1.0 g、1.2 g各3份，精密加入相當于含有量的混合對照品溶液，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，進行HPLC測定，結果見表2。

結果表明，高、中、低三種濃度的加樣回收率均在90%～108%之間，且RSD均小于5%，說明該方法的準確度良好。

2.7 樣品的含量測定

取3批次的麒麟丸按供試品制備方法制備樣品，分別進行HPLC測定，結果見表3和圖2。

結果顯示，三批樣品中橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的色譜峰均能與其它色譜峰良好分離，且分離度均大于1.5，理論塔板數均大于5 000，說明該方法能夠用于不同批次的產品檢測。

3 討論

流動相曾選擇考察了乙腈-磷酸、乙腈-醋酸-醋酸銨、乙腈-三氟乙酸和不同梯度下的洗脫情況，發現在乙腈-0.05%三氟乙酸條件下洗脫色譜峰峰型和分離效果均比較好，因此選擇乙腈-0.05%三氟乙酸作為流動相。

采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm范圍內進行光譜掃描，發現橙皮苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的最大波長分別為282 nm、286 nm、270 nm，此外，3種成分在波長220 nm和230 nm均有明顯的吸收，因此，分別對220 nm、230 nm和270 nm波長下的色譜峰進行分析，發現220 nm波長下各成分的響應值最大，且分離度良好，因此，選擇220 nm作為檢測波長。

由于投料所用藥材批次不同，2016年和2018年批次樣品中的橙皮苷和丹酚酸B含量略有差異。但多批次檢測結果表明該方法簡單適用，可同時檢測3個指標性成分的含量，節約檢測時間和成本，為麒麟丸改進質量控制方法提供參考依據。

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