包埋活性污泥實(shí)現(xiàn)短程硝化微生物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

文_趙昕燕 北京節(jié)能環(huán)保中心

與全程硝化相比,短程硝化可減少硝化過(guò)程25%的需氧量和反硝化過(guò)程中40%的碳源消耗量,同時(shí)具有較低的污泥產(chǎn)量,并且可減少反硝化池容積,成為近幾年新型生物脫氮工藝的研究熱點(diǎn)。短程硝化是通過(guò)控制各種影響因素的方式促進(jìn)AOB的生長(zhǎng)繁殖同時(shí)抑制NOB的生長(zhǎng),達(dá)到縮短反應(yīng)時(shí)間,節(jié)約能源的目的。但作為自養(yǎng)型細(xì)菌，AOB生長(zhǎng)緩慢,容易從反應(yīng)器中流失,在連續(xù)流條件下NO2--N積累不穩(wěn)定,限制了短程硝化技術(shù)的應(yīng)用。

包埋固定化微生物技術(shù)是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域中的一項(xiàng)新興技術(shù),它以高分子材料為載體,將游離細(xì)胞或者酶定位于限定的區(qū)域,使其保持活性并可反復(fù)利用,具有良好的微生物截留效果。

通過(guò)包埋固定化技術(shù)制作短程硝化包埋菌顆粒能有效防止菌體流失,提高細(xì)菌生物量,同時(shí)加強(qiáng)系統(tǒng)的抗負(fù)荷沖擊能力,有利于短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行，活性污泥成本較低,且容易獲得,適合進(jìn)行包埋固定化。近來(lái)各國(guó)對(duì)包埋短程硝化的研究興趣逐漸向微觀方面轉(zhuǎn)移，由原來(lái)探索水利條件來(lái)獲取最佳的處理效果轉(zhuǎn)為對(duì)微觀結(jié)構(gòu)等方面的研究探討。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行研究,可以不經(jīng)過(guò)培養(yǎng)直接從環(huán)境樣品中提取細(xì)菌的DNA或RNA,利用DNA或RNA的微生物遺傳特性進(jìn)行表征,這樣不但避免了傳統(tǒng)上耗時(shí)的菌種分離,更可進(jìn)而鑒定出無(wú)法用傳統(tǒng)方法分離出來(lái)的菌種,克服了傳統(tǒng)微生物分類鑒定方法的不足。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

連續(xù)流試驗(yàn)采用2L有機(jī)玻璃反應(yīng)器,如圖1所示,實(shí)驗(yàn)采用人工配水培養(yǎng)包埋污泥,進(jìn)水水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。

表1 人工模擬廢水成分組成

試驗(yàn)用包埋污泥取自北京某污水處理廠二沉池,取出的污泥經(jīng)4000r/min轉(zhuǎn)速離心濃縮10min,棄清液,得濃縮污泥。以質(zhì)量百分比計(jì),取10%的水性聚氨酯(WPU)溶液與等體積濃縮污泥混合,加入0.24%N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和1.5%過(guò)硫酸鉀(KPS),并迅速攪拌,約30min后混合液凝膠成固態(tài),將固態(tài)膠體切割成3×3×3mm立方體,既得包埋固定化顆粒,將制得的包埋顆粒活化培養(yǎng)一周后備用.包埋劑(WPU)和交聯(lián)劑/引發(fā)劑(N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、KPS)均為分析純。

在連續(xù)流試驗(yàn)條件下,進(jìn)水NH4+-N質(zhì)量濃度為60mg/L,通過(guò)縮短反應(yīng)器水力停留時(shí)間(HRT)的方式,反應(yīng)器中逐漸出現(xiàn)NO2--N的積累,至第26天,反應(yīng)器中的NO2--N積累率達(dá)到65.1%,氨氮去除率達(dá)到95.7%,之后NO2--N積累率和氨氮去除率都呈緩慢上升趨勢(shì),至第60天,反應(yīng)器中的NO2--N積累率達(dá)到79.3%,出水NH4+-N質(zhì)量濃度為1.86mg/L,氨氮去除率達(dá)到96.9%,基本所有NH4+-N都轉(zhuǎn)化為NO2

--N,反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)定的短程硝化。本研究中充分曝氣,水中DO一直維持在4mg/L以上, 并通過(guò)水浴控制反應(yīng)器內(nèi)溫度,保持在室溫21℃左右,進(jìn)水氨氮濃度較低,只有60mg/L,游離氨(FA)不會(huì)成為主要的NOB抑制因素,在以往活性污泥法的研究中,這些條件都不是利于形成短程硝化的因素。但在本研究中,控制反應(yīng)器HRT在2h,之后逐漸降升高至4h,同樣形成了穩(wěn)定的短程硝化,因此分別在連續(xù)流試驗(yàn)各個(gè)階段取樣,進(jìn)行分子生物學(xué)分析,研究包埋菌形成穩(wěn)定短程硝化的內(nèi)在原因。

分子生物學(xué)取樣,第一個(gè)樣取自包埋前活性污泥,第二個(gè)樣取自連續(xù)馴化第26天,第3個(gè)樣取自連續(xù)馴化第60天。分別編號(hào)為樣品R1(接種污泥)、R2(馴化中的短程包埋硝化污泥)和R3(穩(wěn)定短程包埋硝化污泥)，樣品采集后在-20℃下保存。

1.2 樣品總DNA提取

采用上海生工提供的“Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(土壤)”提取DNA后,取5μL提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

針對(duì)總細(xì)菌的PCR擴(kuò)增,以提取的總DNA作為模板,采用對(duì)大多數(shù)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)都具有特異性的引物對(duì)F357-GC(5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCG CCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

采用DCodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離。

1.5 克隆與測(cè)序

對(duì)DGGE電泳后圖譜上的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠回收。對(duì)于選定的每個(gè)條帶,只選擇其中間部分進(jìn)行切割。

1.6 樣品的生物多樣性分析

采用凝膠分析軟件Quantity One對(duì)掃描所得的DGGE圖譜進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 污泥樣品總DNA提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

污泥樣品提取的DNA經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得到的總DNA片段大小約為23kbp,屬于比較完整的細(xì)菌總DNA,適合做下一步PCR擴(kuò)增。針對(duì)總細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果大約為240bp,符合預(yù)期的長(zhǎng)度,適合做下一步DGGE.針對(duì)AOB 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果大約為500bp(第一輪)和250bp(第二輪),符合預(yù)期的長(zhǎng)度,適合做下一步DGGE。

2.2 DGGE指紋圖譜結(jié)果

根據(jù)DGGE技術(shù)原理,圖譜中分離出來(lái)的條帶都是不同種類的微生物的特定區(qū)的DNA片段,每個(gè)條帶原理上可以代表一個(gè)微生物種屬,條帶信號(hào)強(qiáng)度越大表示該細(xì)菌在污泥中的優(yōu)勢(shì)地位越大,且相同位置電泳條帶較多,表明優(yōu)勢(shì)的微生物數(shù)量很多且相似性很高。圖2和圖3分別代表了針對(duì)總細(xì)菌和AOB的16S rRNA基因所得DGGE圖譜。

2.3 細(xì)菌種群多樣性

總細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性特性如圖4所示。可以看出：三個(gè)樣品中穩(wěn)定短程硝化污泥對(duì)應(yīng)的樣品R3的SDI和EI均最高,分別為1.69和0.70,表明穩(wěn)定短程硝化污泥中微生物種群相對(duì)豐富并且分布均勻；馴化期的短程硝化污泥對(duì)應(yīng)的樣品R2的SDI和EI均最低,分別為0.62和0.32,包埋顆粒在固定化過(guò)程中由于包埋試劑的毒性、聚合反應(yīng)的熱效應(yīng)等因素會(huì)導(dǎo)致剛包埋完成的顆粒活性較低,表明短程包埋硝化污泥的馴化過(guò)程會(huì)淘汰部分種群從而降低污泥中微生物種群的多樣性。

AOB種群結(jié)構(gòu)多樣性特性如圖5所示。可以看出：三個(gè)樣品中接種污泥多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)均最低,表明接種污泥AOB種群多樣性低,分布集中。馴化中的短程硝化污泥和穩(wěn)定短程硝化污泥均較接種污泥多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)高,表明穩(wěn)定短程硝化污泥可以富集AOB,這為包埋污泥能夠維持穩(wěn)定的短程硝化提供了微生物學(xué)基礎(chǔ)。

2.4 特征條帶的回收測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

將總細(xì)菌和AOB的DGGE圖譜中部分優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠測(cè)序,在Genbank中進(jìn)行比對(duì),獲得各條序列的同源性信息，從總細(xì)菌部分條帶16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果可以看出,本次試驗(yàn)3個(gè)樣品中的微生物群落主要分布于變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和未培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)。3個(gè)樣品的共有條帶中,條帶1和條帶3分別與Nitrosomonas europaea(KF618624.1)和 Nitrosomonas sp. (KP074927.1)同源性達(dá)到94%和96%,亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)在反應(yīng)器內(nèi)將氨氧化為亞硝酸鹽,作為短程硝化系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群已經(jīng)見諸多報(bào)道；條帶2和條帶5分別與Uncultured bacterium(HQ015447.1)和Uncultured bacterium(GQ421116.1)同源性達(dá)到99%和94%,表明短程硝化系統(tǒng)中的細(xì)菌多樣性豐富,并潛藏著許多未被人們認(rèn)識(shí)的微生物新資源,有待于進(jìn)一步深入研究；條帶6與Alcaligenes sp. (LN864598.1)的同源性達(dá)到了98%,多項(xiàng)研究表明產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌Alcaligenes sp.具有聚磷能力；條帶9與Flavobacterium sp. (KT284905.1)的同源性達(dá)到92%, Flavobacterium被報(bào)道具有廣泛的溶藻能力。這幾種細(xì)菌存在于接種污泥、馴化中的短程硝化污泥和穩(wěn)定短程硝化污泥中,表明其具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,而他們具有的脫氮功能、聚磷功能和溶藻功能都是水處理中功能菌的生化特性。條帶10存在于樣品R1和樣品R3中,與Thiobacillus(NR_074417.1)的同源性達(dá)到90%,該菌是一類硫自養(yǎng)反硝化菌,它具有不需要投放有機(jī)物作為碳源和產(chǎn)生極少量的污泥等優(yōu)點(diǎn)。

從AOB部分條帶16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果和圖7的AOB系統(tǒng)發(fā)育樹可以得到本研究中分離到的亞硝化細(xì)菌(AOB)均與β-Proteobacteria的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)有著較高的相似性(90%～99%),而沒(méi)有與亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)有一定相似性的序列,已有研究證實(shí)絕大多數(shù)的生物反應(yīng)器里Nitrosomonas是AOB中的優(yōu)勢(shì)菌屬,而Nitrosospira只出現(xiàn)在個(gè)別反應(yīng)器里。

3 結(jié)論

（1）短程硝化逐漸穩(wěn)定的過(guò)程會(huì)增加微生物種群多樣性,影響污泥穩(wěn)定性的細(xì)菌被淘汰,而脫氮菌、聚磷菌、溶藻菌和硫自養(yǎng)反硝化菌等污水處理功能微生物都在反應(yīng)過(guò)程中得到保留。經(jīng)包埋固定化穩(wěn)定短程硝化污泥比活性污泥更能有效防止菌體流失,提高細(xì)菌生物量。不同階段培養(yǎng)的污泥相比,穩(wěn)定短程硝化污泥微生物種群多樣性豐富、分布均勻,而馴化中的短程硝化污泥微生物種群多樣性較低、分布集中。3個(gè)樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群主要分布于變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和未培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)。

（2）短程硝化過(guò)程實(shí)現(xiàn)了對(duì)AOB一定程度的富集,與接種污泥相比,馴化中的短程硝化污泥和穩(wěn)定短程硝化污泥中AOB的多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)均有提高,其中穩(wěn)定短程硝化污泥中的AOB多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)最高、接種污泥中AOB的多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)最低。包埋材料具有良好的截留微生物的能力,對(duì)于那些世代周期較長(zhǎng)的微生物如亞硝酸菌提供了較好的環(huán)境。AOB種群分析表明優(yōu)勢(shì)AOB均屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),且出現(xiàn)在短程硝化不同階段的不同菌種,表明該反應(yīng)器污泥內(nèi)部形成的不同環(huán)境條件能夠?yàn)槎喾NAOB提供生存環(huán)境。