TLR4對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡及β-catenin、c-myc蛋白表達的影響

陳南耀，余 丹，陳曉東

1)海口市第四人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 海口 571199 2)海口市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 海口 570208 3)海口市人民醫(yī)院神經(jīng)外科 海口 570208

腦栓塞、休克、顱腦損傷等誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷是引起腦組織功能障礙的重要原因，其中氧化應(yīng)激是缺血再灌注神經(jīng)損傷發(fā)生的重要機制[1]。Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)在人類幾乎所有的組織和器官中均有表達，是一個與炎癥、細(xì)胞生長等有關(guān)的調(diào)控因子[2]。TLR4與神經(jīng)損傷發(fā)生有關(guān)，其在缺氧復(fù)氧損傷的腦神經(jīng)組織中高表達，表達水平與神經(jīng)損傷程度呈正比[3-4]。H2O2可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[5-6]。本實驗以負(fù)載TLR4 shRNA的慢病毒感染大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞，觀察H2O2干預(yù)后細(xì)胞中TLR4的表達，以及細(xì)胞增殖、凋亡能力和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-myc表達的變化，探討TLR4在PC12細(xì)胞氧化損傷中的作用，以期為明確神經(jīng)系統(tǒng)損傷機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料PC12細(xì)胞由中科院細(xì)胞庫提供；TLR4抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；引物由南京金斯瑞合成；TLR4 shRNA慢病毒及對照空病毒均由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建；β-catenin抗體、c-myc抗體購自美國Abcam公司。

1.2實驗分組將PC12細(xì)胞接種到6孔板(種植密度3×104個/孔)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合為40%時，分別添加TLR4 shRNA慢病毒及空病毒液，感染復(fù)數(shù)設(shè)置為10。感染12 h后，棄掉培養(yǎng)上清液，添加細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后，于熒光顯微鏡下觀察，證實干擾效率超過90%。取感染 TLR4 shRNA慢病毒及空病毒的PC12細(xì)胞，用200 μmol/L的H2O2(以細(xì)胞培養(yǎng)液配制)培養(yǎng)6 h，記為shRNA+H2O2組和空病毒+H2O2組。不感染慢病毒的PC12細(xì)胞分別用0和200 μmol/L的H2O2培養(yǎng)6 h，分別記為空白對照組和H2O2組。

1.34組細(xì)胞中TLR4mRNA的檢測分別收集4組細(xì)胞，用PBS洗滌后，Trizol法提取總RNA，按照37 ℃15 min、85 ℃5 s、4 ℃10 min進行反轉(zhuǎn)錄，以合成的cDNA為模板進行熒光定量PCR。引物序列為：TLR4上游5’-GGTGGAAGTTGAAGGAAT-3’，下游5’-AGATGATACCAGCACGAC-3’；GAPDH上游5’-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3’，下游5’-GT GACCAGGCGCCCAATAC-3’。反應(yīng)條件：95 ℃15 s，60 ℃60 s，40個循環(huán)。以GAPDH為參照，采用2-ΔΔCt法計算TLR4 mRNA表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.44組細(xì)胞中TLR4蛋白的檢測分別收集4組細(xì)胞，用PBS洗滌后，加RIPA裂解液于冰上孵育20 min，轉(zhuǎn)移到4 ℃離心機中，12 000×g離心10 min。用移液槍吸取上清，BCA法定量蛋白樣品。常規(guī)方法配制SDS-PAGE凝膠。蛋白上樣量40 μg，上樣前用等體積緩沖液混合煮沸5 min。積層膠電泳電壓為90 V，分離膠電泳電壓為120 V，轉(zhuǎn)膜電壓90 V。蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，以BSA封閉非特異性位點。一抗按照1∶600稀釋，二抗按照1∶4 000稀釋。分別在封閉、一抗孵育和二抗孵育后以TBST洗膜3次。ECL發(fā)光，以Chemi Doc XRS成像。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.5MTT法測定細(xì)胞存活率將PC12細(xì)胞按照3×104個/mL密度種植到96孔板，每孔100 μL，按照1.2分組處理后，每孔分別添加MTT溶液20 μL孵育4 h，棄上清，加DMSO溶解結(jié)晶，于酶標(biāo)儀上測定490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=實驗組A/空白對照組A×100%。實驗重復(fù)3次。

1.6Annexin V-FITC和PI雙染法測定細(xì)胞凋亡分別收集4組細(xì)胞，以PBS配制成106個/mL的細(xì)胞懸液。吸取1 mL細(xì)胞懸液，離心，加200 μL結(jié)合緩沖液，加入各5 μL的PI和Annexin V-FITC染液混合孵育15 min，再添加300 μL緩沖液混勻，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.7Western blot法測定細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平分別收集4組細(xì)胞，用Western blot法測定細(xì)胞中β-catenin、c-myc表達水平。β-catenin、c-myc抗體分別以封閉液按照1∶500稀釋，其余步驟同1.4。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0分析實驗數(shù)據(jù)，4組細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白表達水平、細(xì)胞存活率和凋亡率、細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.14組細(xì)胞中TLR4mRNA和蛋白表達水平的比較見圖1和表1。H2O2組細(xì)胞中TLR4表達水平較空白對照組升高，shRNA+H2O2組細(xì)胞中TLR4的表達較H2O2組降低。

1、2、3、4：分別為空白對照組、H2O2組、空病毒+H2O2組、shRNA+H2O2組

圖1 4組細(xì)胞中TLR4蛋白的表達

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與H2O2組、空病毒+H2O2組比較，P<0.05

2.24組細(xì)胞存活率和凋亡率的比較見表2。H2O2組細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率增加。shRNA+H2O2組細(xì)胞凋亡率較H2O2組降低，存活率升高。

2.34組細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平的比較見圖2和表3。H2O2組細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平較空白對照組降低。shRNA+H2O2組細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平較H2O2組升高。

表2 4組細(xì)胞存活率和凋亡率的比較 %

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與H2O2組、空病毒+H2O2組比較，P<0.05

1、2、3、4：分別為空白對照組、H2O2組、空病毒+H2O2組、shRNA+H2O2組

圖2 4組細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白的表達

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與H2O2組、空病毒+H2O2組比較，P<0.05

3 討論

腦血管疾病的發(fā)生與缺血再灌注損傷有關(guān)[7-9],氧化應(yīng)激是腦組織缺血再灌注損傷的主要機制之一。氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制神經(jīng)細(xì)胞生長，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[10-11]。本研究結(jié)果顯示，H2O2處理后PC12細(xì)胞生長能力降低，凋亡細(xì)胞增多。

TLR4是Toll樣受體蛋白家族成員，能夠識別革蘭陰性菌細(xì)胞壁的有效成分，其在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌損傷、腎小管上皮細(xì)胞損傷等多種細(xì)胞損傷中具有重要的調(diào)控作用[12-13]。目前的研究[14]顯示，TLR4參與機體免疫反應(yīng)和腦缺血損傷發(fā)生，腦缺血損傷可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進而引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)破壞。研究[15]顯示，黃芪甲苷在減輕缺氧復(fù)氧PC12細(xì)胞損傷的同時可以下調(diào)TLR4的表達，TLR4可能參與缺氧復(fù)氧PC12細(xì)胞凋亡過程。本實驗結(jié)果顯示，H2O2處理后PC12細(xì)胞中TLR4蛋白和mRNA表達水平均升高，敲減TLR4后H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞存活率增加，提示TLR4可能在PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮促進作用。

TLR4具有調(diào)控細(xì)胞生長和凋亡的作用，并且對于不同細(xì)胞調(diào)控作用不同。有研究[16-19]表明，TLR4可以抑制神經(jīng)細(xì)胞Wnt信號通路的激活；可以負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞Wnt信號通路，提高細(xì)胞增殖活性；可以激活乳腺癌、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Wnt信號通路，促進細(xì)胞增殖。也有研究[20]表明，抑制Wnt信號通路可以加重百草枯誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果表明，H2O2處理后的PC12細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin及下游靶基因c-myc表達下調(diào)，敲減TLR4可以提高H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達水平，說明敲減TLR4能夠促進PC12細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路的激活，這可能是其抗PC12細(xì)胞損傷的作用機制。

總而言之，TLR4在神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷中可能發(fā)揮促進作用，作用機制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的激活水平有關(guān)。