江西地區3 364例優生優育咨詢患者Y染色體微缺失分析

盧婉 劉艷秋 陸清 吳興武

近年來，不孕不育是人類面臨的一個日益嚴重的健康問題，經流行病學調查大約有15%夫婦可能患有不孕癥，需進行不孕因素的評估，其中男性不育作為唯一不孕因素的約占不孕夫婦的30%，同時合并女性因素共同導致不孕約占20%～30%[1-2]。因此，孕前對男性生育能力的評估也顯得尤為重要。孕前優生遺傳咨詢與檢查也是全國優生優育政策開展落實的重要環節。男性不育的遺傳學病因中被發現頻率最高的兩個是染色體異常(如Klinefelter’s綜合癥)和Y染色體長臂無精癥因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失[3]。AZF基因是在Y染色體的長臂上存在控制精子發生的基因，影響精子的生成，發生在AZF基因的缺失稱為AZF微缺失，也稱Y染色體微缺失。根據AZF基因上不同區域的缺失，通常將AZF微缺失分為AZFa缺失、AZFb缺失、AZFc缺失、AZFd缺失以及多種組合缺失模式[4]。本研究分析了自2016年12月至2018年4月于本院就診的3 364例有生育需求的男性患者Y染色體微缺失結果，探討AZF缺失的發生率、缺失類型及其與男性不育癥的關系，為臨床提供生育指導。

資料與方法

1.研究對象：選擇2016年12月至2018年4月于江西省婦幼保健院產前診斷中心進行優生遺傳咨詢的男性患者2 330例，年齡22～45歲；以及優生咨詢后于輔助生殖中心計劃進行試管助孕的男性不育患者1 034例，年齡22～53歲，不育年限為1～14年，男性不育診斷標準采用世界衛生組織定義[5]。每位患者詳細記錄病史和生育史，按生育史分為已生育組和未生育組，對每位患者抽取外周血，進行AZF基因檢測。同時收集患者精液，嚴格按照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)[5]進行精液常規分析。

2. 檢測試劑：血液核酸提取試劑盒由天隆公司提供，染色體微缺失檢測試劑盒(PCR熒光探針法)由上海透景生命科技有限公司提供。

3. 檢測儀器：天隆NP968磁珠核酸提取儀、核酸濃度檢測儀(NanoDrop)、透景SLAN-48P檢測儀、瓊脂糖凝膠電泳儀。

4.全血基因組DNA提取：嚴格按照試劑盒說明操作，靜脈抽取患者2 ml的EDTA抗凝外周血，混勻后取200 μl采用自動化儀器抽提DNA，使用NanoDrop分光光度計測DNA濃度。

5. PCR擴增及熒光信號定量分析：采用兩管多重PCR擴增，4個通道(FCM/VIC/ROX/Cy5)熒光檢測的方法，判斷AZFa (sY84,sY86)、AZFb (sY127,sY134)、AZFc (sY254,sY255) 3個區域6個序列標簽位點(STS)的微缺失，同時設置兩個內對照基因，即男性性別決定基因(SRY)和編碼鋅指蛋白基因ZFX/ZFY(見表1)。其中A組檢測的位點為SRY、sY84、sY127、sY254；B組檢測的位點為ZFX/ZFY、sY86、sY134、sY255。PCR反應條件設置如下(1)95℃預變性5 min；(2)95℃解鏈15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，38個循環；(3)72℃ 5 min后得到PCR產物，60℃收集FCM/VIC/ROX/Cy5信號，并保存相關文件。

表1 Y染色體微缺失檢測位點及對應區域

6. 瓊脂糖凝膠電泳：PCR產物取10 μl經4.0%瓊脂糖凝膠電泳，100 V/40 min，用凝膠成像系統對DNA條帶進行觀察。陽性對照為AZF各區段均無缺失的正常男性，陰性對照為純水。

7. 統計學處理：所有數據采用SPSS21.0統計學軟件進行處理，計數資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1. 患者生育及不育情況：在3 364例患者中，男性不育癥的患者有1 291例，另外2 073例為尚不足以診斷為男性不育癥或者是單純的優生遺傳咨詢患者。此外根據患者是否有過生育史，將所有患者分為已生育組329例和未生育組3 035例，已生育組中患男性不育癥的(獲得性)有47例，未生育組中則是1 244例。

2. Y染色體微缺失情況：通過AZF基因檢測，共發現33例存在Y染色體AZF基因微缺失。其中2例來自已生育組，缺失率為0.6%(2/329)；31例來自未生育組，缺失率為1.0%(31/3035)。另外，在1 291例男性不育癥患者中，共發現30例存在AZF基因微缺失，缺失率為2.3%(30/1291)。對此33例異常樣本進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果一致(圖1)。在30例AZF缺失的男性不育癥患者中發現24例為AZFc區域缺失，5例AZFb+c區域缺失，1例患者存在AZFa+b+c區域的組合缺失。見表2。

3. AZF 3個區微缺失率比較：分別對33例Y染色體微缺失的患者進行不同區域缺失發生率的比較，發現AZFc區缺失率最高，b區次之，而a區缺失率最低。見表3。

注：圖中“D”代表Y6試劑盒陽性對照；“S1”代表AZFc區缺失標本；“S2”代表AZFb+AZFc缺失標本；“S3”代表AZFa+AZFb+AZFc缺失標本；“S4”代表正常男性標本；“B”代表Y6試劑盒陰性對照圖1 三種Y染色體缺失類型電泳圖

表2AZF缺失的男性不育癥患者Y染色體微缺失類型及發生率 [例(%)]

微缺失類型例數占男性不育癥患者比例(n=1291)AZFc2424(1.8)AZFb+c55(0.4)AZFa+b+c11(0.1)總計3030(2.3)

表3 AZF不同區域微缺失發生率比較

4. Y染色體微缺失與精液常規分析：在所有研究患者中，共收集了2 718例精液常規結果，其中異常結果為840例，異常率為30.9%(840/2 718)。主要表現為精子數量顯著異常、精子活力顯著異常、精液液化時間顯著異常及其他，分別占60.1%(505/840)、25.4%(213/840)、9.0%(76/840)及5.5%(46/840)。在1 291例男性不育癥患者中，精液異常有687例，主要是無精癥患者218例，嚴重少精子癥患者284例，以及其他異常185例。檢出的30例Y染色體微缺失患者均為無精子癥或嚴重少精子癥患者。其中無精子癥患者中有21例發生Y染色體微缺失，缺失率為9.6%(21/218)，包括AZFc區域缺失15例，AZFb+c組合缺失4例和AZFa+b+c組合缺失1例；嚴重少精子癥患者中有9例發生Y染色體微缺失，缺失率為3.2%(9/284)，包括AZFc區域缺失8例和1例AZFb+c組合缺失。見表4。

表4 無精子和嚴重少精子患者Y染色體微缺失分析

討論

世界衛生組織將不孕癥定義為夫婦婚后同居、有規律正常的性生活滿1年、未避孕而未孕者[1]，1997年De Kretser研究發現僅由男性因素所引起的不育約占20%[6]。男性不育的影響因素眾多，主要包括先天性生殖系統異常、內分泌紊亂、免疫反應異常及遺傳學因素等，但因遺傳因素引起的男性不育約占總不育因素的30%，其中15%～20%的男性不育患者表現出無精子癥，以及約10%左右的患者表現出少精子癥[7]。Y染色體的95%是男性特異性的區域，包含性別特異性的胚胎發育的遺傳物質，如睪丸決定基因(sex determining region Y,SRY)。但是Y染色體不像常染色體具有同源體，它不會發生同源重組，其遺傳物質聚集在一條染色體上，若發生缺失則出現生育問題[8]。

AZF是在Y染色體的長臂上存在控制精子發生的基因，影響精子的生成，發生在AZF基因的缺失稱為AZF微缺失。有研究表明[9]，在男性中AZF微缺失的發生率為1/3 000～1/2 000，在不育的男性中，AZF微缺失的檢出率為0.6%～1.0%，而在無精癥和嚴重少精子癥患者中，AZF微缺失的檢出率分別為10%～15%和3%～5%。由此可見，AZF微缺失是導致生精障礙和男性不育最常見的分子遺傳學病因。

AZF區域可分為4個亞區，分別是AZFa、AZFb、AZFc和AZFd，任何1個位點出現缺失，都會表現出男性無精子癥或嚴重少精子癥，導致不育。同時，AZF片段的缺失也會直接影響有絲分裂前期和精母細胞在粗線期的正常配對，造成染色體異常從而導致習慣性流產的發生[10-11]。

本研究中，共發現33例患者存在Y染色體AZF微缺失，其中已生育組有2例，缺失率為0.6%；未生育組有31例，缺失率為1.0%。由此可見，即使是有過正常生育史的健康男性，也有可能因為環境、生活習慣等不良因素而引起獲得性的Y染色體微缺失。此外，在1 291例男性不育癥患者中發生Y染色體AZF微缺失的患者有30例，缺失率為2.3%，與國內外報道基本相符[12-14]。在33例Y染色體微缺失中有26例患者表現為AZFc區域缺失，6例表現為AZFb+c區域缺失，以及1例為AZFa+b+c區域缺失。由此可見，本研究中AZFc微缺失最常見，出現在所有33例Y染色體微缺失患者中，其次是AZFb區域，有7例患者檢出缺失，而AZFa區域缺失僅在1例患者中檢出。

AZFc缺失范圍廣泛，從小的亞帶缺失到染色體內重組，甚至是完全缺失。AZFc最主要的基因是DAZ(deleted in azoospermia)基因，該基因在生殖細胞發展的所有階段都有表達，參與了整個精子發生的全過程。DAZ基因的缺失程度會直接影響臨床表型，表現為少精、弱精或者是無精癥[15]。AZFb缺失約占缺失類型的5%～15%，涉及的缺失都是大缺失，包括AZFb和AZFb+c缺失。本研究未發現AZFb的單獨缺失，而AZFb+c的缺失比例較高，約為18.2%(6/33)。臨床表現為生精阻滯，多停留在精母細胞階段，可能的原因是X、Y染色體配對過程中所需基因缺失，導致減數分裂中期染色體不配對，引起生精障礙[16]。AZFa缺失較為罕見，本研究中只發現1例AZFa+b+c的組合缺失，臨床表現為唯支持細胞綜合征(sertoli cell-only syndrome,SCOS)，嚴重無精癥同時伴有睪丸體積縮小[3,17]。

在1 291例男性不育患者中，有高達502例患者表現為無精子癥或嚴重少精子癥，30例患者出現Y染色體微缺失，缺失率為6.0%。其中無精子癥患者218例，21例患者出現Y染色體微缺失，缺失率為9.6%，嚴重少精子癥患者284例，9例患者出現Y染色體微缺失，缺失率為3.2%。由此可見，Y染色體微缺失是男性無精子或嚴重少精子導致的男性不育的重要因素。

此外有研究表明[18]，當無精癥患者攜帶AZFa或AZFb區域缺失時，睪丸組織無精子產生，不建議通過睪丸穿刺尋找和提取精子，患者欲獲取后代只能通過供精實現。而AZFc區域缺失的患者中有約50%的機會可以在睪丸組織中提取到精子[19-20]。因此，及時進行Y染色體微缺失的檢測不僅對男性不育癥的診斷有非常重要的意義，而且可以避免不孕癥夫婦不必要的手術和藥物治療，便于按照其實際情況制定干預方案，完成患者的生育愿望。正確的孕前優生遺傳咨詢，早檢測早診斷，將為由Y染色體微缺失導致男性不育的早治療提供更大的可能。