長期高氟飲水對小鼠基礎痛閾的影響

劉 飛,吳甜甜,張千千,郭青玉

(西安交通大學口腔醫學院陜西省牙頜疾病臨床研究中心,西安 710004;*通訊作者,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn)

氟化物廣泛存在于自然界的水、空氣、巖石和土壤中,也被添加至牙膏、漱口水中,過量攝入氟化物會對機體產生毒性[1]。急性氟中毒最常見的癥狀有胃腸道反應,包括胃痛、惡心、嘔吐、胃腸道出血以及肌肉痙攣等。慢性氟中毒多表現為氟斑牙(dental fluorosis)、氟骨癥(skeletal fluorosis)以及一些非骨相器官的損傷[2]。在高氟飲水地區居住10年以上的居民多患有氟斑牙;每天飲水攝氟量超過0.2 mg/kg,氟化物沉積于骨組織,形成氟骨癥,導致骨骼脆性增加、強度下降。

飲水中的氟化物是人和動物攝入氟最普遍的方式,占攝入總氟量的60%。飲水中的氟更容易被機體吸收,經口攝入的氟化物被胃腸吸收的吸收率約為80%-97%。流行病學調查顯示,在高氟飲水區生活超過20年的居民出現背部疼痛、關節炎及膝部疼痛等。Namkaew等[3]對泰國清邁省的Poo-kha和On-tai兩個地區的飲用水含氟濃度與居民慢性疼痛癥狀之間的劑量-反應關系的回顧性研究發現,534名年齡大于50歲的當地居民存在慢性疼痛,尤其是腰背部的疼痛,與每日飲用水中的含氟量存在明顯的相關性。此外,使用氟化物治療骨質疏松患者時,會出現顯著的下肢疼痛副反應[4,5]。

本研究給予幼年小鼠高濃度的氟化物飲水,模擬自然條件下含氟飲水地區的生活環境,在成年后測量小鼠的基礎痛閾,為闡明氟化物所致疼痛癥狀的機制提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

錄像追蹤系統(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain);Von Frey纖維絲(North Coast Medical Inc,Morgan Hill,USA);熱板儀(RB-200,成都泰盟科技有限公司);氟化鈉(分析純,天津市恒興化學試劑制藥有限公司);甲醛溶液(分析純,南京化學試劑有限公司)。

1.2 實驗動物

4周齡雄性C57/BL小鼠24只,體質量(14±2)g,由西安交通大學醫學院動物中心提供(SPF級,動物合格證編號為SCXK(陜2012-003))。小鼠被隨機分為對照組和實驗組,每組12只。飼養室溫(22±1)℃;日光燈采光,光暗周期12 ∶12;每4只在同籠飼養,自由采食和飲水,每周更換消毒墊料1次。

1.3 飲用水加氟處理

除小鼠的飲水外,其余飼養條件均完全一致。按飲用水中是否添加氟化物將小鼠分為:對照組,飲用蒸餾水;實驗組,飲用100 mg/L的氟化鈉溶液。飲水加氟的時間持續于整個實驗周期,即鼠齡4-10周,共計6周。

1.4 一般狀況及體質量

在小鼠4周齡至10周齡之間,每周周末稱取并記錄各組小鼠的體質量,同時觀察各組小鼠的牙齒、皮毛、精神狀態和反應靈敏度等體征。

1.5 曠場實驗(open field test,OFT)

將小鼠置于45 cm×45 cm×45 cm的曠場測試箱中,使用錄像追蹤系統(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain)記錄小鼠在實驗開始后的前10 min及總60 min內的運動路程。

1.6 Von Frey纖維絲實驗

由小鼠4周齡起,每周使用Von Frey纖維絲(North Coast Medical Inc,Morgan Hill,USA)測試其機械痛閾直至鼠齡8周,共5次。11根Von Frey纖維絲對應的機械力值依次為0.008,0.02,0.04,0.070,0.16,0.40,0.60,1.0,1.4,2.0,4.0 g。安靜環境下,將小鼠置于半透明有機玻璃籠中,限制其過度活動。金屬網格底板小孔每邊長約1 mm。測試前先讓小鼠適應環境30 min,室溫控制在(20±2)℃。測試根據文獻[12,13]的方法進行:由0.008 g纖維絲開始依次對小鼠左后爪中心處施加壓力至纖維絲呈C型,當小鼠出現縮爪或甩爪時為陽性反應,每根纖維絲施力每次2 s,間隔15 s,共10次。記錄首次出現≥2次陽性反應的力值作為疼痛閾值;按公式相對縮爪頻率=10次施力中總陽性反應次數/10×100%,計算相對縮爪頻率。

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1.7 熱板實驗(hot plate test,HPT)

鼠齡9周時進行HPT,實驗前5 min將熱板儀器(RB-200智能熱板儀,成都泰盟科技有限公司)預熱至設定溫度,控制室溫為(20±2)℃。將小鼠置于熱板上的玻璃罩內密切觀察小鼠的活動。一般情況下,大多數小鼠在熱刺激下出現不安狀況,如舉前肢、抬后肢、跳躍、舔咬后爪等,記錄小鼠首次跳躍或舔咬后爪出現的時間作為痛閾的指標,稱為潛伏期。連續測試3 d,每天3次取平均值;實驗前熱板儀器選擇不同的預設溫度,依次為(46±1)℃,(50±1)℃,(54±1)℃;為避免小鼠燙傷,設定保護時間為30 s,若30 s內小鼠未出現疼痛反應,則停止實驗并以30 s記錄為其潛伏期。

1.8 福爾馬林實驗(formalin test,FT)

鼠齡10周時進行FT,實驗開始前將小鼠放入30 cm×15 cm×15 cm的透明有機塑料玻璃測試盒框中適應30 min。實驗時,于小鼠右后爪皮下注射5%的福爾馬林溶液50 μl,迅速將小鼠放入測試盒框中,呈45°角放置一塊鏡子于測試箱后以便觀察者更好地觀測小鼠的行為。60 min內,每10 min由兩名不知情人員觀察并記錄小鼠的舔咬爪時間及甩爪次數,取平均值用于統計[14]。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 一般狀況及體質量

在整個飼養過程中,蒸餾水對照組小鼠活動正常,毛色光亮;實驗組小鼠在給氟前期(4-6周齡)精神和行為均未見異常,進食和飲水正常,體毛柔順;自小鼠8周齡時觀察到給氟組小鼠常蜷縮少動,皮毛略皺縮,部分小鼠切牙出現氟斑牙癥狀,呈淡黃色斑塊狀。兩組小鼠飼養前體質量組間均衡性好,給氟飼養后,體質量增長無統計學差異(P>0.05,見圖1)。

圖1 長期高氟飲水對小鼠體質量的影響Figure 1 Effect of long-term high fluoride in drinking water on body weight of mice

2.2 長期高氟飲水對小鼠曠場實驗中運動距離的影響

在曠場實驗中,前10 min及總60 min內的總運動路程兩組小鼠無統計學差異(見圖2)。

2.3 長期高氟飲水對小鼠機械刺激痛的影響

在Von Frey纖維絲實驗中對鼠齡4-8周中疼痛閾值的監測可見,對照組小鼠的痛閾未發生明顯變化,曲線平緩;實驗組小鼠痛閾呈下降趨勢。在鼠齡7周和8周時,實驗組小鼠痛閾顯著低于對照組小鼠,且兩組小鼠的痛閾整體比較有統計學差異(P<0.001,見圖3A)。

在Von Frey纖維絲實驗中對小鼠4-8周相對縮爪頻率的監測可見,在鼠齡4周時兩組小鼠的相對縮爪頻率并無差異(見圖3B);5-6周時實驗組小鼠的相對縮爪頻率整體高于對照小鼠(見圖3C-D);7-8周時實驗組小鼠在多個纖維絲對應的力值處相對縮爪頻率高于對照組小鼠,并表現出整體上的差異(見圖3E-F)。

A.實驗開始后前10 min運動距離 B.實驗總60 min內運動距離圖2 長期高氟飲水對小鼠曠場實驗中運動距離的影響Figure 2 Effect of long-term high fluoride in drinking water on distance of exercise in open field test

實驗組與對照組相比疼痛閾值(P<0.001)，5周(P<0.05)、6周(P<0.05)、7周(P<0.01)、8周(P<0.001)相對縮爪頻率整體均數差異有統計學意義;與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖3 長期高氟飲水對小鼠機械刺激痛的影響Figure 3 Effect of long-term high fluoride in drinking water on mechanical pain of mice

2.4 長期高氟飲水對小鼠熱刺激痛的影響

在HPT中,兩組小鼠均可觀察到溫度依賴的潛伏期縮短現象,且在第1天及第3天(熱板溫度分別為46 ℃和54 ℃時),兩組小鼠的疼痛反應潛伏期均未見統計學差異;在HPT第2天(熱板溫度為50 ℃)時,實驗組小鼠疼痛反應潛伏期明顯短于對照組小鼠(P<0.05,見圖4)。

2.5 長期高氟飲水對小鼠炎性刺激痛的影響

在1 h的觀察期內,實驗組小鼠甩爪次數整體多于對照組小鼠;在早時相(0-10 min)和晚時相(20-60 min),以及40 min,50 min,60 min三個時點,實驗組小鼠甩爪次數均多于對照組小鼠,具有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

在1 h的觀察期內,兩組小鼠的舔咬爪時間整體比較未見統計學差異;在早時相(0-10 min)內實驗組小鼠的舔咬爪時間顯著長于對照組小鼠,而晚時相(20-60 min)內兩組小鼠舔咬爪時間無統計學差異(見圖5)。

與對照組相比,*P<0.05圖4 長期高氟飲水對小鼠熱刺激痛的影響Figure 4 Effect of long-term high fluoride in drinking water on thermal pain of mice

實驗組與對照組相比甩爪次數整體差異有統計學意義(P<0.001);與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖5 長期高氟飲水對小鼠炎性刺激痛的影響Figure 5 Effect of long-term high fluoride in drinking water on inflammation pain of mice

3 討論

本研究通過給予4周齡小鼠氟化鈉飲水,在飼養過程中監測體質量變化并進行多次Von Frey hair實驗,在小鼠成年后進行OFT、HPT及FT,結果表明長期高氟飲水環境會導致小鼠成年后對急性機械刺激痛、急性熱刺激痛以及慢性炎性疼痛的敏感性顯著增加。

本研究觀察到兩組小鼠體質量均呈正常增長,各組間差異無統計學意義,與Chioca等[6]的結果一致。也有學者觀察到給氟組動物體質量增長緩慢的同時,攝食、攝水量下降,據此推測可能是由于飲食攝入量下降影響動物體質量增長[15]。但是在本研究中,限于條件,我們沒能精確計算動物的攝食量,只觀察到兩組小鼠的體質量在各個觀察點無統計學差異,因此NaF對動物體質量的影響仍需進一步研究。

OFT可以用于檢測小鼠的自發活動[16],本實驗中兩組小鼠在實驗開始后的前10 min內以及總60 min中的總運動路程均無顯著性差異,表明含氟飲水并未對小鼠運動能力產生影響。

有研究表明,氟化物可破壞動物的運動系統而降低小鼠的運動功能,原因可能為氟離子置換骨骼中羥基磷灰石的羥基,形成氟磷灰石,造成骨骼發育異常;也可能是由于氟化物抑制了與能量產生、傳導有關的酶活性,從而使肌肉功能受損所致[17]。傷害感受行為的測試大多是基于觀察動物對痛刺激的逃避行為,因而動物的基礎運動能力的改變會顯著影響實驗結果,如在動物運動能力喪失或降低的情況下得到傷害感受行為改變的實驗結果很有可能是假陽性。本實驗中首先排除了兩組小鼠一般生長發育情況及運動能力的異常,這為其他傷害感受性行為的可靠性提供了保證。

Von Frey纖維絲實驗和HPT均用于構建動物的急性疼痛模型,前者為急性機械刺激痛模型[18],后者為急性熱刺激痛模型[19]。這些測試通常采用逃避行為/回縮反射或者發聲作為疼痛指標。在這些模型中,動物的行為反應導致傷害刺激的終止。在本實驗中,給予幼年小鼠含氟飲水一段時間后,實驗組小鼠的急性機械痛閾逐漸低于對照組小鼠。在HPT中,兩組小鼠均出現溫度依賴的潛伏期縮短,在溫度為46 ℃時實驗組小鼠疼痛反應潛伏期呈現出低于對照組小鼠的趨勢,但差異無統計學意義;在溫度為50 ℃時實驗組小鼠疼痛反應潛伏期顯著低于對照組小鼠;溫度為54 ℃時三組之間的疼痛潛伏期差異消失。該現象可能是由于溫度過高時(54 ℃)熱刺激過于強烈,各組小鼠均表現為快速的跳躍或舔咬后爪作為逃避反應,從而消除了組間差異。

FT是目前國內外進行炎性痛研究中經典的動物實驗模型。它是通過向動物后爪皮下注射少量傷害性化學刺激物(甲醛溶液),記錄動物在化學刺激物作用下對被傷害腳爪的舔咬(licking and biting)以及收縮(flinching)行為[20]。該過程一般分三個階段,第一階段(早時相)為急性傷害性反應,從注射后立即開始,持續約5-10 min,是由于甲醛主要引起了C類纖維的興奮,直接刺激了傷害性感受器所致,是短暫的急性痛反應;中間階段為靜息期;第三階段(晚時相)從注射后20 min開始持續到注射后60 min,這個階段可觀察到動物由于組織的炎性反應產生的痛覺應答。在本實驗中,高濃度氟化物飲水小鼠在FT的兩個疼痛時相中的反應均較對照組小鼠顯著,表現為甩爪次數的增多和舔咬爪時間的增長。

關于氟化物引起疼痛的原因,目前研究較少。Schnitzler等[21]認為這種疼痛癥狀是骨源性的。他們對5位骨質疏松的患者使用每日1.09 mg/kg氟化物治療,患者均出現疼痛癥狀,通過影像學檢查發現其存在骨小梁應力性微結構骨折[21]。但是Desmond等[22]對11位骨質疏松患者給與平均78 mg/d氟化鈉治療后出現相似的疼痛癥狀,對其進行連續的X線觀察,僅有5位患者存在應力性微骨折,其余的患者并未表現出明顯的骨性損傷,Desmond等[22]由此認為應力性微骨折并不是造成疼痛唯一的原因,而是整個疼痛過程的一個組成部分。此外,還有學者推測過量的氟化物可能抑制胰島素的生成而導致高血糖,從而導致大鼠的疼痛癥狀[23]。因此,本實驗觀察到的含氟飲水引起的小鼠基礎痛閾下降的外周和中樞機制尚有待進一步研究。

本研究通過給予小鼠高濃度氟化物飲水,在生長過程中及成年后通過疼痛行為學實驗評價,發現飲用水中含高濃度氟化鈉(100 mg/L)的小鼠基礎痛閾顯著降低,對包括急性機械刺激痛、急性熱刺激痛以及慢性炎性疼痛的反應更為明顯。這一實驗結果為探究慢性氟中毒患者疼痛癥狀出現的原因和機制提供了動物模型。