無籽沙糖桔WUBE1基因的功能驗證

李鵬，苗紅霞，胡桂兵，秦永華*

(1.華南農業大學園藝學院，廣州 510642；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海口 571101)

植物的生長和發育離不開短命調控蛋白的有選擇性降解，其中一種重要的降解方式就是泛素/26S蛋白酶體途徑(Ub/26S途徑)[1]。在這個途徑中，泛素(ubiquitin,Ub)和26S蛋白酶體起著至關重要的作用，需要被降解的蛋白會通過泛素活化酶E1(UBE1)、泛素結合酶E2(UBE2)和泛素連接酶E3(UBE3)參與并由Ub進行標記，隨后標記蛋白會被26S蛋白酶體識別并降解[2-5]。經過這個循環,Ub/26S途徑會有效地去除不正常的蛋白和大部分短命調控蛋白。Ub/26S途徑是植物中高效專一蛋白降解調控機制之一，參與植物激素應答[6-7]、花的生長發育[8]、非生物脅迫應答[9-10]、植物免疫應答[11-12]、光形態建成[13]、花粉萌發和花粉管伸長[14-15]、自交不親和的發生[16]等環節。在植物自交不親和反應中，Ub/26S途徑可以降解一些特異蛋白質，最終使花粉萌發受到抑制或花粉管停止生長[16-18]。目前有關Ub/26S途徑關鍵酶的研究主要集中在UBE2和UBE3上，而對于UBE1的研究報道很少。雖然已經從香蕉(Musa nana)、番木瓜(Carica Papaya)、番茄(Lycopersicon esculentum)、玉米(Zea mays)、小麥(Triticum aestivum)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotiana tabacum)和茶樹(Camellia sinensis)等植物中分離到UBE1基因，但UBE1的功能仍不清楚。有研究表明，UBE1可能參與了植物的逆境脅迫響應、果實成熟發育以及采后成熟過程[19-21]。而有關UBE1基因在植物的自交不親和反應中的功能研究還未見報道。

無籽沙糖桔(Citrus reticulata‘Wuzishatangju’)是本課題組從有籽沙糖桔芽變中選育的新品種[22],屬于配子體型自交不親和[23]。我們的前期研究表明,WUBE1基因在無籽沙糖桔花藥和自交后3 d的花柱中明顯上調表達，而在異交授粉后3 d花柱中幾乎不表達；酵母表達試驗證明，加入外源WUBE1蛋白可以顯著抑制無籽沙糖桔的花粉萌發率，推測WUBE1很可能參與了無籽沙糖桔自交不親和反應[24]。本研究擬采用農桿菌介導法將來源于自交不親和無籽沙糖桔的WUBE1基因導入煙草，為闡明WUBE1在無籽沙糖桔自交不親和反應中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

以培養在MS培養基上的煙草(Nicotianatabacum)W38葉片為材料。質粒為pBI121-WUBE1[WUBE1基因來源于自交不親和品種無籽沙糖桔(Citrus reticulata‘Wuzishatangju’)，農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株，均由本實驗室保存。

1.2 方法

煙草遺傳轉化和分子檢測通過根癌農桿菌介導的煙草葉盤轉化法[25]將pBI121-WUBE1轉化煙草，獲得抗性植株。用改良CTAB法提取抗性植株葉片的總DNA[25]，以pBI121-UBE1質粒為陽性對照，野生型植株葉片的基因組DNA為陰性對照，進行多重引物(NPT II、35S、WUBE1和ChvA)的PCR檢測(表1)。對PCR檢測為陽性的植株基因組DNA用EcoR I內切酶于37℃水浴中酶切過夜,用0.7%瓊脂糖凝膠電泳后轉移到尼龍膜上固定。用PCR-DIG探針標記試劑盒制備地高辛標記的NPT II探針片段，然后進行雜交、顯影和定影[26]。用華越洋生物超快型植物RNA提取試劑盒提取轉WUBE1基因單拷貝植株葉片總RNA。用M-MLV逆轉錄酶進行第一鏈cDNA的合成，具體步驟參照試劑說明書。以煙草β-actin為內參基因(表1)，用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測外源基因在不同轉基因植株中的表達情況[27]。

轉基因煙草的花粉生活力和發芽率測定將花粉均勻涂在1%瓊脂+0.01%硼酸+10%蔗糖的培養基上，置于25℃～30℃培養箱中培養6 h，在顯微鏡下觀察記錄花粉生活力和發芽率。每個處理重復3次，每個重復觀察3個視野，每個視野不少于30粒花粉。

表1 用于檢測的引物和PCR反應程序Table1 Primers and PCR procedure used in this study

轉基因煙草授粉受精過程的觀察參照陶書田等[28]和史公軍等[29]的方法并略作修改。以野生型自交和轉WUBE1基因煙草自交及異交授粉后不同時間的雌蕊(柱頭、花柱和子房)為材料，分別在授粉后1、2、3、4、5和6 d采集發育正常的雌蕊，用卡諾氏固定液I(無水酒精∶冰醋酸=3∶1)固定12～24 h，固定液中的酒精逐級下行過渡到蒸餾水為止。雌蕊縱切后用4%NaOH溶液軟化透明，用蒸餾水洗凈，置于載玻片上，0.1%苯胺藍染液染色30 min，蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡(OLYMPUS BH2-RFCA，日本)下觀察，用數碼顯微照相系統(OLYMPUS DP70，日本)進行拍照。

轉基因煙草果莢中的種子數量選取轉基因煙草植株進行自花授粉和異花授粉(轉WUBE1基因煙草×野生型煙草)，以野生型煙草自花授粉為對照，種子成熟后，選取相同數量且大小一致的煙草果莢，分別統計單個果莢中的種子數量。

2 結果和分析

2.1 轉WUBE1基因煙草的分子檢測

利用根癌農桿菌介導法將含有WUBE1基因的植物表達載體轉化煙草，經過浸染、共培養、抗性篩選和生根培養，獲得了132株抗卡那霉素(KanR)植株。用NPT II、35S、WUBE1和ChvA(農桿菌結合蛋白基因)引物對KanR植株進行PCR檢測，有103株KanR植株擴增出的特異條帶與陽性對照擴增出的特異條帶一致，且沒有農桿菌污染，而非轉基因的煙草植株則沒有特異性條帶出現(圖1)。這初步表明外源基因UBE1已整合到煙草基因組中。

對PCR鑒定結果進一步驗證，陽性植株以DIG標記的NPT II基因為探針進行Southern雜交。結果表明，外源基因WUBE1以1～3個拷貝整合到煙草基因組中(圖2)。這說明外源基因WUBE1已成功整合到煙草基因組中。

分別提取轉WUBE1基因煙草單拷貝植株和野生型植株葉片的RNA，并反轉錄合成cDNA第一鏈。以煙草β-actin為內參基因，用qPCR檢測轉基因煙草和野生型煙草葉片中外源WUBE1基因的相對表達量。由圖3可知，WUBE1在轉基因煙草植株葉片中都有表達，而在野生型煙草中沒有表達。

2.2 轉WUBE1基因煙草花粉生活力和發芽力

結果表明，轉WUBE1基因煙草和野生型煙草的花粉均可以正常萌發且有活力。轉WUBE1煙草的花粉生活力和發芽率分別為82.6%和69.1%,與野生型煙草的花粉生活力和發芽率無顯著差異(表2)。

圖1 煙草植株的PCR檢測。M：DL Marker 2000；P：陽性對照；WT：野生型；1～22：轉WUBE1基因抗性植株；A：NPT II引物；B：35S引物；C：ChvA引物；D：WUBE1引物。Fig.1 PCR analyses of tobacco.M：DL Marker 2000；P：Positive control；WT：Wild type；1-22：KanRtransgenic plantlets with WUBE1；A：NPT II primer；B：35S primer；C：ChvA primer；D：WUBE1 primer.

圖2 轉WUBE1基因煙草植株的Southern雜交結果Fig.2 Southern blots of transgenic tobacco with WUBE1

圖3 WUBE1基因在轉基因煙草植株葉片中的表達Fig.3 Expression of WUBE1 in leaves of transgenic tobacco

表2 野生型和轉WUBE1基因煙草的花粉生活力和發芽率Table2 Viability and germination rate of pollen in transgenic WUBE1 and WT tobacco

2.3 轉WUBE1基因煙草授粉受精過程觀察

在熒光顯微鏡下，野生型煙草自交、轉基因煙草自交和轉基因煙草×野生型煙草異交授粉后花粉粒呈金黃色，花粉管與染色劑反應發出綠色熒光,可見花粉管先端的精核和營養核亮點。授粉1 d后，自交和異交的花粉粒均已萌發，部分花粉管通過柱頭乳突細胞間隙進入柱頭(圖4：A1～C1)；授粉2 d后，自交和異交的花粉粒都大量萌發，且大部分的花粉管都已進入花柱(圖 4：A2～C2)；授粉 3 d后,花粉管在花柱中不斷伸長，且部分花粉管開始盤繞卷曲(圖4：A3～C3)；授粉4 d后，不論是自交還是異交授粉，部分花粉管出現盤繞卷曲生長(圖4：A4～C4)；授粉5 d后花粉管到達花柱基部(圖4：A5～C5)，但轉WUBE1基因的自交授粉組合到達花柱基部的花粉管數量少于異交授粉和野生型自交組合，且部分花粉管出現停止生長的現象(圖4：B5)；授粉6 d后，自交與異交的花粉管均已進入子房(圖4：A6～C6)。由此可見，轉WUBE1基因煙草自交和異交的花粉管都能完成授粉受精。

2.4 轉WUBE1基因煙草的種子數量

由圖5可知，轉WUBE1基因煙草自交和異交授粉后平均每個成熟果莢中的種子數與野生型煙草相比，無顯著差異。

3 結論和討論

UBE1是蛋白泛素化所需的第1個酶，在Ub/26S途徑中發揮重要作用。UBE1具有1個保守的與泛素結合的Cys位點，同時還有1個保守的核苷酸結合位點，可以與ATP或AMP-Ub結合。UBE1的活性很高，在細胞中只要很低的濃度就可以激活泛素，通過水解ATP來獲取能量，并通過其活性位置半胱氨酸殘基與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素途徑，然后UBE1將泛素轉移到UBE2的絲氨酸殘基上。最后，通過UBE3識別底物蛋白，泛素甘氨酸與底物蛋白質賴氨酸殘基的ε-氨基酸形成異肽鍵,將目標蛋白泛素化和降解[2,4,30]。Ub/26S途徑是導致植物自交不親和的重要途徑,其中UBE1、UBE2和UBE3會共同作用，通過調控信號傳導元件泛素化并降解一些特異蛋白質如SRNase，從而抑制花粉管的生長與延伸[16-18]。在配子體自交不親和反應中，SLF是花粉S決定因子,它含有1個F-box結構域，F-box蛋白是SCF E3復合

圖4 轉WUBE1基因煙草授粉受精過程觀察。A：野生型自交；B：轉基因煙草自交；C：轉基因煙草×野生型煙草。標尺=100μmFig.4 Pollination and fertilization of transgenic tobacco with WUBE1.A：WT×WT；B：Transgenic tobacco×transgenic tobacco；C：Transgenic tobacco×WT.Bars=100μm

圖5 煙草成熟果莢中的種子數量Fig.5 Seed number per pod of tobacco

體的底物識別蛋白[31]。在金魚草(Antirrhinum majus)的異交授粉中，AhSLF-S2與Skp、Cullin-1ike蛋白結合，形成了SCF復合體，SCF AhSLF-S2這個具有UBE3活性的復合體會與非我S-RNases非特異性地結合，使S-RNases被泛素化，最后通過Ub/26S途徑將S-RNase降解，花粉管得以繼續生長[18]。在矮牽牛(Petunia inflata)中，所有的SLF都會直接或間接識別所有的非自我S-RNase，協助非自我SRNase的聚泛素化，進而降解[32]。在孢子體自交不親和反應中，單亞基的RING UBE3 ARC1(arm repeat containing 1)是正向調控因子主要參與者之一。ARC1的下調會使部分自交不親和信號的轉導受到阻礙。自花授粉時,SRK會被SCR/SP11磷酸化，磷酸化的SRK激酶域使ARC1磷酸化，最后磷酸化的ARC1會與Exo70A1蛋白結合，并通過U-box結構與同源UBE2作用,使底物泛素化，進而導致自交不親和反應的發生[33]。這些研究表明，Ub/26S途徑中的UBE2和UBE3參與了調控植物自交不親和反應。UBE1作為Ub/26S途徑的第1個參與酶，其在植物的自交不親和反應中的作用尚不清楚。

本課題組的前期研究結果表明，UBE1很可能參與了無籽沙糖桔的自交不親和反應[24]。本研究通過根癌農桿菌介導法將來源于自交不親和無籽沙糖桔的WUBE1基因轉化煙草，獲得了轉WUBE1基因煙草植株，經PCR、Southern和qPCR檢測表明，外源基因WUBE1已整合到煙草基因組中并得到表達。對轉WUBE1基因煙草授粉受精過程的觀察表明，轉WUBE1基因煙草自交花粉管在花柱延伸的過程中，部分花粉管停止伸長生長，這與酵母表達試驗中的結果一致[24]。但轉WUBE1基因煙草自交和異交的花粉管均能完成授粉受精，且平均每個成熟果莢中的種子數與野生型煙草無顯著差異。這些研究結果表明，單獨的WUBE1基因不能調控無籽沙糖桔自交不親和反應，它很可能通過Ub/26S途徑中的UBE2和UBE共同作用參與了無籽沙糖桔自交不親和反應。