油莎豆快速繁殖體系的研究

李佳婷,高靜陽,孫春雨,萬小榮,吳平治,陳雅平,李美茹,姜華武,吳國江*

(1.仲愷農業工程學院,a.園藝園林學院,b.農業與生物學院,廣州 510225；2.中國科學院華南植物園,中國科學院植物資源保護與可持續利用重點實驗室,廣州 510650；3.中國科學院大學,北京 100049)

根據國家海關總署數據，2017年我國食用油籽進口量達1.02×108t，已超過我國食用油籽消費量的70%，早已超過了國際糧油安全預警線，而我國食用油消費量最大的大豆油，2017年進口了9.554×107t大豆原料，對外依存度高達87%。因此尋找新型食用油油料植物資源已成為克服我國糧食安全的重要途徑之一。油莎豆(Cyperus esculentus)可作為主糧的有效補充和新的食物來源[1]，干產量可達7.5 t hm-2以上[2]。2007年油莎豆油被我國認證為無公害農產品,2012年又被認證為有機產品。此后農業部分別于2015年11月和2016年6月發文建議適宜地區示范推廣種植油莎豆,以調整種植結構和增加新的食用油來源[3]。

油莎豆又名油莎草、鐵荸薺、洋地栗，是莎草科(Cyperaceae)莎草屬的多年生草本植物，常作一年生作物栽培，以塊莖繁殖，是目前已知的能夠在塊莖貯藏大量油脂的唯一作物[4]。原產于非洲地中海地區，1952年首次由北京植物園從蘇聯引進，1960年又再次從保加利亞引進[5]。油莎豆適應性極強,全生育期為70～150 d，3月初至7月均可播種[2]。油莎豆喜溫暖濕潤氣候，耐旱、耐澇、耐貧瘠且耐鹽堿，最適宜沙壤土。

我國油莎豆的遺傳多樣性很低，現有優良品種很少。加之油莎豆在我國氣候條件下一般不開花或者開花不結實，因此利用常規雜交方法培育新的優良品種比較困難[3]。而長期用塊莖繁殖，易出現品種退化、遺傳不穩定、品質下降、帶菌嚴重等問題。組織培養是加速植物繁殖的一種簡單、快捷的有效方法，可以實現優良品種的種質創新、種苗的規模化生產[6]，在農業生產上得到越來越廣泛的應用。目前，國內外對油莎豆的組織培養和快繁技術研究較少，大大限制了油莎豆的遺傳育種和種質創新。因此，本文以油莎豆莖尖為外植體，以MS為基本培養基，通過添加不同濃度的6-BA、KT、NAA進行叢生芽誘導和生根誘導，從而建立油莎豆快速繁殖的離體培養體系，為高效繁育油莎豆優質種苗和種質資源優化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為中國科學院華南植物園能源植物組從云南省保山市收集并保存的小粒型油莎豆(Cyperus esculentus)塊莖。

1.2 塊莖處理

選取飽滿、無蟲眼、帶完整芽眼的塊莖，將表面的須根與鱗片除凈，用自來水沖洗后浸泡3 d,期間經常換水。先用75%乙醇浸泡1 min，用無菌水清洗5～6次，再用7.5%(W/V)次氯酸鈉浸泡50 min后用無菌水清洗1～2次。為徹底去除雜菌，用加有0.05%(V/V)Tween-20和500 mg L-1頭孢的無菌水清洗2～3次，最后用無菌水清洗2～3次。置于無菌紙上吸干塊莖表面水分，移至頂芽誘導培養基MS+0.2 mg L-1NAA+0.5 mg L-16-BA+500 mg L-1頭孢+30 g L-1蔗糖+8.0 g L-1瓊脂，pH 5.8[7]。

1.3 叢生芽增殖培養

以MS培養基為基本培養基，按表1添加生長調節劑，調節pH至5.8。生長調節劑按L9(3)4正交試驗進行設計，生長調節劑有3種：6-BA、KT、NAA,每種設置3個濃度水平，6-BA：0.5、1.0、2.0 mg L-1；KT：0、0.2、0.5 mg L-1；NAA：0、0.02、0.2 mg L-1。每瓶接種6個外植體，每處理接種7瓶，重復3次。每周觀察試管苗生長情況，培養4周后統計肉眼可見的叢生芽個數，增殖系數=(叢生芽總數-外植體總數)/外植體總數。

1.4 生根培養

以MS和1/2MS為基本培養基，以不添加生長調節劑、添加0.1 mg L-1IBA或者NAA為處理，pH為5.8。每瓶接種6個外植體，每處理接種7瓶，重復3次。觀察試管苗的生根時間和根生長狀況，10 d后統計平均生根率和平均生根數，平均生根率=生根的外植體數/外植體總數；平均生根數=生根總數/外植體總數。

培養溫度為(25±2)℃，每天光照14 h，黑暗10 h,相對濕度為(55±5)%，光強為150μmol m-2s-1，所有培養基均添加3%蔗糖和0.8%瓊脂。

2 結果和分析

2.1 組織培養過程

消毒后的塊莖置于頂芽誘導培養基約1周，塊莖開始萌發(圖 1：A)。切割莖尖為單芽(圖 1：B)，用70%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞浸泡10 min，用加有0.05%(V/V)Tween-20的無菌水清洗3次，再用無菌水沖洗5次，置于無菌紙上吸干表面水分，接種至MS+0.05 mg L-1NAA+0.5 mg L-16-BA培養基上(圖 1：C)，pH 5.8，10 d 左右可誘導出新芽(圖 1：D)，2個月后得到大量叢生芽(圖1：E)。選取長勢一致的無菌苗為外植體進行生根誘導。

圖1 油莎豆的組織培養Fig.1 Tissue culture of Cyperus esculentus

2.2 生長調節劑對叢生芽增殖的影響

從表1可見，3個生長調節劑對叢生芽增殖的影響為6-BA＞NAA＞KT。方差分析(表2)表明，6-BA對叢生芽增殖的影響顯著，NAA和KT的影響不顯著。由圖2可以看出，6-BA對叢生芽增殖起促進作用，而NAA則起抑制作用。綜合極差分析和方差分析，若僅考慮生長調節劑對叢生芽增殖的影響，生長調節劑的最佳組合為A3B2C1，即2.0 mg L-16-BA+0.5 mg L-1KT，增值系數為9.49。但叢生芽的增殖系數不能成為油莎豆快繁的唯一指標，經觀察6-BA雖對油莎豆叢生芽增殖有促進作用，但對葉狀莖的生長隨濃度增大有顯著的不利作用，較高濃度的6-BA誘導出的新芽出現葉片卷曲、新生芽弱小的現象(圖3：S8,S9),因此油莎豆試管苗增殖過程中6-BA的濃度不應過高。因此，生長調節劑的最佳組合為1.0 mg L-16-BA+0.2 mg L-1KT，此時增殖系數為7.58。

表1 油莎豆叢芽增值L9(3)4正交試驗直觀分析表Table1 Visual analysis of the L9(3)4orthogonal experiment of Cyperus esculentus proliferattion

表2 油莎豆叢生芽增殖的方差分析Table2 Variance analysis of clump shoot proliferation of Cyperus esculentus

圖2 油莎豆叢生芽增殖系數與生長調節劑水平的效應曲線Fig.2 Effect curve between level of growth regulator and proliferation coefficient of Cyperus esculentus

2.3 生根培養

將叢生芽移至生根培養基中，芽能正常生長,沒有新的叢生芽增殖，2～3 d開始生根。從表3可見,不加任何生長調節劑，MS培養基的生根率和平均生根數均高于1/2MS培養基的，而添加0.1 mg L-1IBA或NAA的情況則相反。從圖4可見，MS培養基誘導的根較為細長，雖然添加0.1 mg L-1NAA的培養基(R3,R6)平均生根數較多，但是根短而粗。綜合來看，最優生根培養基為MS培養基,生根率可達88.10%，平均生根數為2.04。

3 討論

對于主要通過營養塊莖、球莖、塊根等繁殖的植物，如山藥(Rhizoma dioscorea)、半夏(Pinellia ternata)、木薯(Manihot esculenta)等，傳統繁殖方式不僅擴繁速度慢，耗費種莖多，成本高，且長期營養繁殖容易積累病害，以組織培養技術為基礎的離體快繁是目前最廣泛和最有效的一種高效繁育種苗和優化種質資源的技術。正交試驗是多因素多水平分析的有利工具，可用最少的處理組合數來研究較多的試驗因素。本研究同時分析了3種因素3個水平對油莎豆無菌苗增殖的影響，若不采用正交設計的方法，則需安排33=27組試驗，采用正交設計只需要9組試驗。正交設計方法已在北蒼術(Atractylodes chinensis)[8]、金線蓮(Anoectochilus roxburghii)[9]、山薯(Dioscorea fordii)[10]、康乃馨(Dianthus caryophyllus)[11]、空心蓮子草(Alternanthera philoxeroides)[12]等植物組織培養中成功應用。

圖3 油莎豆叢生芽培養4周的生長情況。S1～S9見表1。Fig.3 Growth of clump shoots of Cyperus esculentus cultured for 4 weeks.S1-S9 see Table1.

表3 油莎豆叢生芽的生根培養Table3 Root induction of clump shoots of Cyperus esculentus

圖4 油莎豆叢生芽的生根。R1～R6見表3。Fig.4 Rooting of clump shoots of Cyperus esculentus.R1-R6 see Table3.

植物生長調節劑的種類、水平及組合對植物組織的增殖十分重要。細胞分裂素是植物組織培養過程中促進組織分化和生長的物質，不同細胞分裂素種類及濃度對組培苗的增殖效果不同[13-14]。本研究結果表明，對油莎豆叢生芽增殖影響最大的是6-BA,誘導產生的叢生芽較多，但植株不夠健壯；而KT誘導的叢生芽少，但生長較為健壯，這與張慧英等[15]對荸薺(Eleocharis tuberosa)的快繁研究結果一致。本研究中高濃度6-BA與KT配合使用并未達到叢生芽多且生長健壯的效果，可能與KT的濃度有關，這有待進一步的研究。

韓曉勇等[16]報道MS+0.5mgL-16-BA+0.1mgL-1NAA培養基對鐵棍山藥莖段的不定芽誘導效果較好，豐鋒等[17]認為MS+2.5 mg L-1KT+0.04 mg L-1NAA培養基對淮山藥繼代增殖培養效果較好，蔡建榮[18]報道MS+6-BA0.5 mg L-1+NAA0.1～0.5 mg L-1培養基較適合寸金薯莖段的不定芽誘導，潘梅等[19]認為MS+2.0 mg L-16-BA+0.3 mg L-1NAA對‘桂淮6號’的不定芽增殖效果最好。這說明對同一物種不同基因型叢生芽增殖所需的植物生長調節劑種類和濃度存在一定的差異。目前對油莎豆的組織培養研究報道很少，瞿萍梅等[7]認為油莎豆增殖培養基為MS+0.5 mg L-16-BA，而本研究結果表明MS+1.0 mg L-16-BA+0.2 mg L-1KT培養基對油莎豆叢生芽繼代增殖較好，這可能與試驗材料的基因型不同有關。

瞿萍梅等[7]報道油莎豆的最佳生根培養基為1/2MS+0.2 mg L-1IBA，吳瓊[20]認為油莎豆只能在1/2MS培養基中生根，而本研究結果表明，油莎豆叢生芽可以在MS培養基上生根，這可能與試驗材料的基因型差異有關，說明本試驗建立的油莎豆無菌苗快速繁殖體系需根據油莎豆的不同基因型做進一步的調整，但本快繁系統叢生芽誘導時間短,數量較多，生長較健壯，生根誘導時無需添加任何生長調節劑，成本較低，可為油莎豆優質種苗的高效繁育及其種質資源的優化奠定基礎。