向日葵MADS-Box基因HAM23-like克隆和表達分析

蘇周,吳雨,雷豆,韋小英,何卓遠,楊軍,鄒建

(西華師范大學西南野生動植物資源保護省部共建(教育部)重點實驗室,四川 南充 637009)

花器官發育是陸生植物在生殖進程中的重要過程，該過程對于開花植物的有性生殖具有極其重要的意義。在進化過程中，由于自然選擇的作用和花器官的起源不同，不同開花植物之間形態上存在多樣性[1-3]。典型的雙子葉植物的花從外到內由4輪不同的花器官組成，第1輪是萼片，第2輪是花瓣，第3輪是雄蕊，第4輪是心皮[4]。經典的ABC模型將假定參與花發育的基因分為ABC 3類。其中,A類基因控制萼片和花瓣，該類基因功能缺失將導致萼片和花瓣變成心皮和雄蕊；B類基因控制花瓣和雄蕊，該類基因失活花瓣和雄蕊將變成萼片和心皮；C類基因控制雄蕊和心皮，該類基因的缺失將引起雄蕊和心皮變成花瓣和萼片[4]?，F有的研究顯示，ABC模型中參與花器官發育調控基因中大多數都屬于MADS-box基因家族[5]。

MADS-box基因家族在動物、植物和真菌中廣泛存在，其在植物生長發育的各階段發揮著重要的調節作用[6-7]。MADS 是MCM1、AGAMOUS、DEFICIENS和SRFS的首字母縮寫組成。其中MCM1(minichromosome maintenance1)的功能是調節細胞周期、生長、代謝、專一性和決定細胞類型[8]；AGAMOUS(AG)和DEFICIENS(DEF)均是花器官基因的編碼蛋白,分別來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)和金魚草(Antirrhinum majus)；SRF(serum response factor)為人類血清應答因子[9-11]。這些基因均具有一個由56～58個氨基酸組成的高度保守結構域，稱為MADS-box結構域，故將其命名為MADS-box基因[12-13]。MADS-box基因不僅參與調控開花時間，決定花分生組織的發生和花器官特征，而且在根、葉、胚珠和果實的發育過程中也起著重要作用[6-13]。Koo等的研究結果顯示，過表達AGL6基因會造成擬南芥提前開花[14]；此外番茄中的研究證明了MADS-box家族成員rin基因參與果實成熟的調控，而SlMBP21基因則控制番茄萼片的大小[15-16]。

向日葵(Helianthus annuus)是典型的菊科(Compositae)植物，頭狀花序由外輪不育的舌狀花(缺乏雄蕊和雌蕊)和內部可育的管狀花組成。迄今為止,在形態學方面對菊科植物花形態和發育進行了大量研究，但從分子遺傳學的角度來看，這一種類極多的被子植物科的花序和花的發育仍不清楚，而MADS-box基因在影響花形成的所有階段都發揮著重要的作用[17]。到目前為止，關于向日葵的MADS-box基因研究較少，在控制花序形態發生方面，僅有9個向日葵MADS-box基因被分離和報道，包括2個A類基因HAM 75和HAM 92，影響花瓣和種皮的形成；4個B類基因HAM31、HAM2、HAM63和HAM91；2個C類基因HAM45和HAM59,HAM59參與花分生組織的終止，并與HAM45共同確定雄蕊和雌蕊；1個E類基因HAM137[17-18]。研究向日葵的MADS-box基因，能深入了解MADS-box基因對向日葵營養生長和生殖生長的影響。目前對向日葵的MADS-box transcription factor 23-like基因尚未見研究報道。本文從向日葵花中克隆了1個與花發育相關含有MADS-box結構域的基因，通過NCBI對其進行序列比對，確定為向日葵MADS-box transcription factor 23-like(HAM23-like),利用在線生物軟件對其編碼蛋白進行理化性質和生物信息學分析，隨后采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對該基因的表達模式進行分析，為探究HAM23-like基因的功能及MADS-box基因對向日葵花發育的調控作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料是向日葵光霧山野生葵品種(Helianthus annuus‘GWMountainWild’),種于溫室(光 /暗 =16 h/8 h，28℃/24℃)中。分別采集根、莖、葉、花、果實(MSt，籽粒飽滿階段)后用液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

E.Z.N.A?Plant RNA Kit購于OMEGA；熒光定量染料試劑SYBR?Premix ExTaqTMⅡ、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)等購自寶生物(TaKaRa)公司；FastPfuFly DNA聚合酶、克隆載體pEASY?-Blunt Cloning Kit、大腸桿菌DH5α購于北京全式金。其余化學試劑均為國產分析純級。

1.2 總RNA提取和合成cDNA

在開花前 35(-35)、-25、-15、-10、-5、0 d(開花當天)、開花后5 d(未成熟果實)采集花；并在向日葵開花當天分別采集根、莖、葉、果實(籽粒飽滿階段)及6種花器官：苞片、雌蕊、冠毛、花瓣、雄蕊、子房。材料采集后，按照E.Z.N.A?Plant RNAKit試劑盒說明書提取各組織的總RNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2000c檢測提取RNA的濃度和純度。以所得RNA為模板參照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，合成cDNA。

1.3 基因克隆

根據向日葵全發育時期表達譜庫454和向日葵花發育時期轉錄組數據庫(均未上傳NCBI)篩選到的基因序列，并在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中比對獲得目的基因登錄號(XM_02213319 8.1),根據基因序列設計特異性引物transcription factor 23-F/R，以反轉錄第一鏈cDNA為模板，擴增transcription factor 23基因全長序列。PCR擴增體系共 50μL，包含 cDNA 模板 3μL，transcription factor 23-F/R 引物各 1μL，5×buffer 10μL，dNTP 4μL,ddH2O 30μL 和 FastPfu Fly DNA 聚合酶 1μL，均加入200μL離心管中，用槍尖沖打混勻。擴增程序為98℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1.5 min，34 次循環，72℃延伸5 min。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠回收，連接到pEASY?-Blunt vector克隆載體,并轉入大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態細胞中，在含100 mg L-1Kan的LB培養基中37℃恒溫培養過夜，篩選出陽性轉化細胞，送至上海生物工程公司測序。

1.4 系統發育樹的構建

利用NCBI中在線軟件ORF Finder對所有擬南芥和向日葵MADS-box基因序列進行分析，推導出編碼的氨基酸序列。擬南芥MADS-box基因由擬南芥數據庫獲得利用MEGA 6.0軟件構建擬南芥(https：//www.arabidopsis.org/)和向日葵 MADS-box的系統發育樹，預測向日葵HAM23-like基因與擬南芥的親緣關系。

1.5 HAM23-like的生物信息學分析

利用在線軟件ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale)和 ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam/)分別對HAM23-like基因編碼蛋白的親/疏水性和理化性質進行預測。

使用DNAMAN 8.0軟件對HAM23-like、擬南芥Agamous-like 18的氨基酸序列和朝鮮薊(Cynara cardunculusvar.scolymus)、萵苣(Lactuca sativa)和番茄(Lycopersicon esculentum)等高等植物的MADS-box transcription factor 23-like基因編碼的氨基酸序列進行同源比對。

1.6 HAM23-like的表達模式

采用實時熒光定量法檢測，利用Primer primer 5.0設計HAM23-like基因的實時熒光定量引物，以向日葵eF1A為內參基因(表1)。以提取的向日葵cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，擴增體系為：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 5μL，Transcripition factor 23-F/R各 1μL，ddH2O 2μL，模板 cDNA 1μL。PCR 反應在CFX96 Real-Time PCR儀(Bio-Rad,美國)上完成,3次重復。先確定最適解鏈溫度(melting temperature,Tm)，再構建標準曲線，最后進行檢測。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

2 結果和分析

2.1 HAM23-like的克隆

以向日葵總RNA反轉錄所得cDNA為模板,用HAM23-likeF/R引物進行PCR擴增，得到與預測大小一致的條帶(圖1)。為了驗證克隆準確性,挑選10個單克隆菌落進行測序，測序片段為956 bp，包含了HAM23-like基因完整的開放閱讀框(ORF)。

2.2 HAM23-like的生物信息學分析

從NCBI中BLAST比對找到HAM23-like基因的序列，再通過NCBI的CD Search搜索HAM23-like基因編碼蛋白的保守結構域，結果表明HAM23-like的ORF為831 bp(圖2)，編碼276個氨基酸。該基因編碼的蛋白具有保守的MADS-box和K-box結構域,分別位于氨基酸序列的第46～119和128～211位(圖3)。利用在線分析網站ExPASy對HAM23-like蛋白進行組分分析，相對分子質量為30.52 kD，理論等電點為9.42，屬于不穩定蛋白，不穩定指數為55.03；脂溶性指數為76.03；親水性平均值(GRAVY)為-0.683。蛋白中包括正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)46個，負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)35個，分別占總氨基酸數的16.7%和12.7%。疏水性最強和親水性最強的氨基酸分別是位于第91位的Ile(1.944)和264 位的 His(-3.778)(圖 4)。

圖1 HAM23-like的擴增。M：DL2000 DNA Marker。Fig.1 PCR of HAM23-like.MDL2000 DNAMarker.

將推測的向日葵HAM23-like基因與其他植物MADS-box基因編碼的氨基酸序列進行同源比對,結果表明HAM23-like具有典型MADS-box保守結構域，即MIKC結構域。隨后構建了基于MADS-box基因編碼氨基酸序列的擬南芥和向日葵系統發育樹(圖5)，包括9個已報道的向日葵MADS-box氨基酸序列和本研究挑選出的8個疑似與花發育相關的MADS-box氨基酸序列。結果表明，HAM23-like蛋白與擬南芥的AGL18蛋白聚在同一分支上，說明兩者有較高的親緣關系。

將HAM23-like基因與擬南芥Agamous-like 18、朝鮮薊、萵苣和番茄的MADS-box transcription factor 23-like基因等編碼的氨基酸序列進行同源比對，結果表明(圖6)，HAM23-like在第46～119位有典型的MADS-box保守結構域,擬南芥AGL18蛋白和朝鮮薊、萵苣及番茄的MADS-box transcription factor 23-like蛋白的保守結構域分別位于第2～75、2～74、43～115和 2～77位，說明 MADS-box蛋白的保守結構域具有高度相似性。同時，HAM23-like與朝鮮薊的MADS-box transcription factor 23-like相似度最高，達到81%；可能向日葵與擬南芥屬于不同科,存在一定的差異，與擬南芥的AGL18的相似度不高。

2.3 HAM23-like的表達分析

圖2 HAM23-like基因序列和編碼的氨基酸序列Fig.2 Sequence of HAM23-like and encoded amino acid sequence

圖3 HAM23-like蛋白的保守結構域Fig.3 Conversed domain of HAM23-like protein

圖4 HAM23-like蛋白的親、疏水性預測Fig.4 Prediction of hydrophobicity and hydrophilicity of HAM23-like protein

圖5 擬南芥和向日葵MADS-box蛋白的系統發育樹。A：擬南芥；c：向日葵。Fig.5 Phylogenetic tree of MADS-box proteins in Arabidopsis and Helianthus.A：Arabidopsis thaliana；c：Helianthus annuus.

圖6 向日葵HAM23-like的氨基酸序列與其他植物的同源性比較Fig.6 Homology comparison of Helianthus annuus HAM23-like protein with other plants

圖7 HAM23-like在不同組織中的表達Fig.7 Expression of HAM23-like in different tissues

組織表達模式分析結果表明(圖7)，HAM23-like基因在向日葵的根、莖、葉、花和果實中均有表達，在花的表達量最高，其次是果實，莖中的表達量最低。HAM23-like基因在花中的最高表達量達到了莖中表達量的24倍。這說明HAM23-like可能在花發育和果實的形成過程中起重要的作用。

對花發育6個時期(-35至0 d)和果實發育早期(5 d，未成熟果實)及開花當天的6個花器官中HAM23-like基因的表達量進行分析，結果表明(圖8)，花發育的整個過程中，HAM23-like基因的表達量逐漸升高，尤其在開放前5 d(-5 d)表達量激增,并在完全開放時達花期最高值，在果實發育早期HAM23-like基因表達達到整個生命周期的峰值,這表明HAM23-like可能在向日葵開花過程和果實發育早期發揮重要的調控作用。同時，在開花當天,HAM 23-like在雄蕊和子房有表達，且雄蕊中的表達量極高，這說明HAM 23-like可能對雄蕊和花粉的形成起重要的調控作用,也對果實早期的形成有著一定的影響。

3 討論

高等植物生活周期史中，生殖發育或花發育是極其重要的一個環節，受到遺傳因素和外界環境的雙重影響，是開花基因在時間和空間順序上的表達與外部環境的影響共同作用的結果[19-20]。植物花發育進程涉及到光周期、春化、自主和赤霉素等信號途徑[21]。此外，MADS-box家族轉錄因子的調控作用也是該進程不可或缺的因素[22]。然而，MADS-box家族對植物生長的調控作用體現在多個方面，不僅參與花分生組織的發生和花器官形態建成的調節[23]，還與控制開花時間[24-31]、調節側根生長[32]、果實、胚珠和種皮的形成有關[33-37]。

圖8 HAM23-like在不同開花時間和不同花器官的表達量Fig.8 Expression of HAM23-like in different flowering day and floral organs

本研究從向日葵中克隆了1個MADS-box基因HAM 23-like，對其編碼的蛋白質進行了生物信息學分析，同源對比結果表明HAM 23-like具有典型的MADS-box保守結構域。系統發育分析表明HAM 23-like與擬南芥的AGL18親緣關系最近。有研究表明；AGL18參與擬南芥花器官發育和角果發育的調控；過表達AGL18會延長生長周期和花器官的衰老和脫落，抑制開花[23]。因此，我們推測向日葵HAM23-like基因作為AGL18的同源基因也可能參與花發育進程調控。AGL18基因在擬南芥營養生長期幾乎所有部位有表達，僅新生葉片和下胚軸中沒有表達；在生殖生長期從未成熟的花蕾到花粉和種皮均可表達，且其在根、花和角果中的表達量較高[23]。本研究結果表明，HAM23-like基因在向日葵的根、莖、葉、花和瘦果中均有表達，以花和瘦果的表達較高，這與AGL18基因在擬南芥的表達模式較為相似。這進一步說明HAM23-like基因為AGL18的同源基因，也暗示HAM23-like基因可能具有與AGL18基因相似的功能，參與調控向日葵花的形成和開放，而調控方式和調控部位是否相同還有待于進一步研究。

目前，擬南芥和水稻中分別報道了MADS-box基因107和75個[38-43]，而有關向日葵的MADS-box基因報道卻很少。HAM75和HAM92對花瓣和種皮的形成有影響[17]，HAM59和HAM45共同確定雄蕊和雌蕊的形成[18]。但還未見能同時影響雄蕊和果實形成的MADS-box基因。HAM 23-like在花發育過程各階段均有表達，以開花前5 d、開花當天和開花后5 d的表達量相對較高，且HAM 23-like僅在雄蕊和子房中表達，雄蕊的表達量遠高于子房。在擬南芥中AGL18基因未成熟的花蕾、花粉，角果和種皮均具有較高的表達水平[23]。說明向日葵HAM23-like基因也具有擬南芥AGL18基因相似的生物學功能，主要與花發育后期的花器官和花粉發育以及瘦果和種皮早期發育有緊密聯系。然而該基因是否在花開放和果實形成過程中起到決定作用還不清楚,而且HAM23-like基因是否和AGL18基因一樣對向日葵花器官發育發揮負調控作用也需要進一步的驗證[23,44]。

本研究對HAM23-like基因及其編碼蛋白的理化性質、結構和功能的預測和分析，以及對該基因在向日葵組織表達的特性進行定量分析，為探究HAM23-like基因在向日葵花發育過程的調控作用提供科學依據。