無患子嫩枝扦插生根機理初探及對不同激素處理的響應

何必庭，何秋陽，劉濟銘，史雙龍，高世輪，翁學煌，賈黎明

（1.龍泉市林業科學研究院，浙江 龍泉 323700；2.北京林業大學 國家能源非糧生物質原料研發中心，北京 100083；3.福建源華林業生物科技有限公司，福建 三明 354500）

無患子Sapindus mukorossi為無患子科Sapindaceae無患子屬Sapindus落葉喬木，廣泛分布于亞洲和美洲的熱帶、亞熱帶低山丘陵及石灰巖地區[1-3]，主要在我國秦嶺淮河以南以散生或小居群形式分布。無患子果皮皂苷和種仁油脂含量豐富，是重要的生物日化、生物柴油、生物醫藥等原料樹種[2-3]。目前，在我國福建、浙江、貴州、云南、湖南等地已陸續發展了數萬公頃的人工原料林[4]，但目前栽植多為未經子代測定的實生群體，普遍產量較低。其主要原因是缺乏優良品種及其繁育技術。

扦插育苗是林木優良品種無性快速擴繁的重要手段之一，由于其繁殖系數高、繁殖速度快、操作簡易等優勢在實際生產中得到廣泛應用[5-6]。嫩枝扦插是一個復雜的生理生化過程，受不同植物、不同品種、不同個體、環境以及扦插基質、插穗自身狀況、生根激素或生根粉的種類與濃度等因素的影響，成活率表現出巨大差異[7-10]。國內外關于無患子扦插技術的研究已有相關報道，主要集中在扦插插穗類型、扦插基質、扦插時間和激素處理的優選過程。在對無患子扦插試驗中發現，通過一定濃度的激素浸泡處理并對扦插環境加以控制，無患子扦插的成活率可達70%以上[11-13]，而阮雙興[14]發現不同濃度NAA處理的無患子穗條成活率不足46%，2年生插穗成活率不足33%。這些差異可能是由于扦插的基質、插穗狀況、處理方式等不同導致。目前尚無試驗總結出無患子可應用于生產的系統扦插擴繁技術，關于無患子扦插生根機理更是未見相關報道。

在借鑒無患子科樹種扦插擴繁技術國內外研究進展的基礎上，本文以無患子為研究對象，采用不同激素處理研究無患子嫩枝扦插的生根機理，以期找到適用于無患子的簡單快速無性繁殖育苗途徑，探索其生根機理，為無患子優良種質快繁提供理論與技術支撐。

1 試驗地概況

試驗地位于福建省西北部的三明市建寧縣，116°35'～117°04'E，26°30'～27°06'N，閩江源頭[15]，海拔280～1 858 m，年平均氣溫16.5～17.5℃，年平均降水量1 800～2 100 mm，多集中于春夏兩季，常年相對濕度84%，平均日照時數達1 721 h[16]。土壤為長石砂巖風化母質上發育而成的厚層山地黃紅壤，土層厚度＞100 cm，多以紅壤為主[17]，質地多為重壤土（卡氏制）至輕黏土，肥力較高，具有良好的水濕條件，適宜林木生長[18]。建寧縣森林覆蓋率達78.3%，植物種類多達1 300種，近年來大力發展無患子原料林培育，2012年獲中國經濟林協會授予“中國無患子之鄉”稱號，是我國發展無患子生物質能源原料林的主要基地。

本試驗在福建省建寧縣斗埕工業區源容生物科技有限公司扦插大棚中進行。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

試驗材料選自福建省建寧縣無患子家系種質資源圃。2017年6月中上旬于晴朗清晨采集3年生實生苗當年生無病蟲害健壯嫩枝，長20～100 cm，直徑1.5～2 cm。插穗制作在背陰地進行，剪除梢部和基部，下端剪成馬蹄形斜切面，上端平切面，去除幼嫩梢部，插穗長10～13 cm。每段插穗保留2～3個芽眼，除去下部所有葉片，保留上部1～2片小葉，葉量較多或葉片過大時將葉片剪去一半或1/3，隨采隨插隨處理。

扦插基質采用泥炭土：珍珠巖以2：1的比例均勻混合，將基質盛裝在口徑10 cm，深20 cm的PVC育苗容器內，使用1：200 0的多菌靈溶液（多菌靈型號：Zhb/中保生產的PD85150-2殺菌劑XK13-003-00387）澆透容器內基質進行消毒。在扦插大棚內苗床上挖淺坑，間距25 cm×15 cm，將盛裝好基質的容器放置在淺坑內，并用土壘實，防止容器翻倒。

2.2 試驗設計

試驗采用完全隨機區組實驗設計，設置3種激素的3種不同濃度，加上清水對照（CK）共10個處理，每個處理3次重復，每個重復25個插穗。激素選用NAA，IAA，GGR6的不同濃度溶液處理插穗，激素濃度分別為 100 mg·L-1，200 mg·L-1，500 mg·L-1，處理時間將插穗基部4 cm左右激素浸泡1 h，激素種類與濃度組合設計見表1。

為便于觀察扦插苗生根情況，另取100根插穗使用200 mg·L-1GGR6處理1 h并進行扦插，作為破壞性試驗所需的扦插苗。

表1 不同激素處理及水平Table1 Different hormones with different levels

2.3 插后管理

將處理后的插穗直插入基質中，芽眼朝上，插穗上端3～5 cm露出基質，插后將孔口縫隙捏實以使插穗基部與基質完全接觸。扦插后采用棚內自動噴霧裝置進行管理（10:00-17:00，每30 min噴霧1次，每次3 min），噴霧同時起到了維持空氣濕度和基質水分的作用，使白天棚內空氣溫度維持在25～30℃，相對空氣濕度在80%左右，同時扦插基質始終保持濕潤狀態。生根后則適當控制水分，并噴施2 000倍液的多菌靈。及時除去棚中雜草。陰雨天適當關閉噴霧裝置，防止水分過多導致棚內過于潮濕，使扦插苗澇死。

2.4 扦插育苗生根解剖學研究

扦插后每隔5 d將破壞性試驗苗隨機拔出1～2根，觀察愈傷組織生長及生根情況。扦插前取3根未經處理的插穗，扦插后每隔2周隨機抽取3根插穗進行觀察并保存，與未處理的插穗一起制作石蠟切片，取代表性切片通過顯微鏡觀察拍照。

2.5 指標測定方法

2.5.1 插穗成活率的測定 2017年11月對扦插成活率進行觀測統計。

2.5.2 幼苗生物量、根系指標的測定 在觀測結束后對無患子扦插苗進行采樣。每個處理隨機采集3株扦插苗全部葉片與根系，分別放入信封并標號，當天將葉片烘干至恒重，使用電子天平（賽多利斯公司產，型號SQP）稱量其生物量并記錄；將根系清水洗凈，用EPSON掃描儀（EPSON公司產，型號V19）和Epson Twain Pro根系掃描系統進行掃描，得到根系數據。掃描結束后將根系裝回信封并烘干至恒重，使用電子天平稱量其生物量并記錄。稱量后的根、葉裝回信封保存待測。

2.5.3 幼苗營養成分的測定 將烘干后的根、莖、葉樣品使用球磨儀（德國RETSCH，冷凍混合研磨儀MM400）粉碎并保存在干燥潔凈的自封袋中并標上樣品序號。按照消煮流程將樣品消煮后，將得到的消煮液倒入標有樣品序號的100 ml小口方瓶（hdpe材質方形水劑瓶）內待測。

使用AA3連續流動化學分析儀（德國SEAL產，型號AA3）測定待測樣品的含磷量與含氮量。

2.6 數據分析

采用SPSS Statistics 20對試驗數據進行One-wayANOVA分析，如處理間差異顯著，采用Duncan法在0.05或0.01水平上進行多重比較。采用Microsoft Excel 2016進行圖表繪制。

3 結果與分析

3.1 嫩枝扦插成苗過程及其生根類型

嫩枝扦插過程中，愈傷組織約在25 d后出現，28 d時大量形成愈傷組織，33 d出現不定根，40 d正常生長形成茁壯苗木，70 d根團形成，扦插苗木可移栽定植（圖1）。對不同時期無患子嫩枝扦插苗木通過形態觀測和切片觀察，發現嫩枝扦插苗于28 d于皮下形成根原基，33 d形成不定根（圖2），生根部位多集中于皮下和愈傷組織中（圖3）。

圖1 無患子嫩枝扦插苗（200 mg·L-1GGR6處理）15，30，70 d時生根情況Figure1 Rooting of cuttings 15,30 and 70 days after treatment of 200 mg·L-1GGR6

圖2 無患子扦插苗皮下生根（左）與愈傷組織生根（右）Figure2 Rooting from hypodermis(left)and callus(right)of cutting

圖3 無患子嫩枝扦插基部切片觀測Figure3 Slice observation of cutting base

3.2 不同激素處理對嫩枝扦插成活率的影響

研究表明（圖4），采用GGR6，IAA及NAA處理可顯著提高無患子嫩枝扦插成活率（P＜0.05），方差分析表明多數處理與對照相比差異顯著（P＜0.05）（除c’13，c’22，c’32）。多重比較發現c’31處理下成活率顯著高于其他處理（P＜0.05），扦插成活率可達46.96%，比CK高42.24%；其次是c’12處理成活率達33.15%。綜合分析認為，200 mg·L-1GGR6處理成活率最高，500 mg·L-1IAA處理成活率最高，100 mg·L-1NAA處理成活率最高。

3.3 不同激素處理對嫩枝扦插苗生物量的影響

由圖5分析表明，各處理相比于CK，扦插苗生物量均有所提高，其中部分處理差異顯著（P＜0.05）。c’31處理的總生物量生長最高達到3.05 g，比CK處理高出將近6.5倍；平均每株扦插苗根、葉最高生物量分別達到1.32 g，1.73 g，分別比CK高出915%，409%。多重比較發現c’31處理嫩枝扦插苗根、葉總生物量最高，其次為c’22。綜合分析也發現隨著GGR6，NAA激素處理濃度的升高，嫩枝扦插苗根、葉生物量都逐漸下降，IAA激素則在200 mg·L-1處達到峰值，500 mg·L-1處跌入谷底。

圖4 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插成活率 Figure4 Survival rate of cuttings treated by different hormones and different concentrations

注：圖中不同字母表示差異達顯著水平（P＜0.05），下同。

3.4 不同激素處理對嫩枝扦插苗營養成分的影響

由圖6可看出，各處理相比于CK，嫩枝扦插苗根、莖、葉含氮量均有所提高，最高的分別是c’22，c’33，c’11，達到 4.90 mg·kg-1，3.50 mg·kg-1，6.04 mg·kg-1，分別比 CK 高出 227%，90%，158%。方差分析表明多數處理根、莖、葉含氮量存在顯著性差異。多重比較表明，IAA，NAA處理下根含氮量顯著高于CK與GGR6處理（P＜0.05），在500 mg·L-1NAA處理下的莖含氮量顯著高于其他處理（P＜0.05），在100 mg·L-1GGR6處理下葉含氮量顯著高于其他處理（P＜0.05）。分析認為GGR6可有效提高嫩枝扦插苗葉含氮量，NAA能有效提高根、莖部分含氮量。

圖6 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根、莖和葉的含氮量Figure6 Nitrogen content in root,stem and leaf of cutting treated by different hormones and concentrations

圖7 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗 根、葉的含磷量Figure7 Phosphorus content in root and leaf of cuttings treated by different hormones and concentrations

由圖7可知，各處理相比于CK，嫩枝扦插苗葉、根含磷量均有所提高，大部分處理莖含磷量并無顯著差異，其中c’21處理下葉含磷量最高，達到2.47 mg·kg-1，比CK處理高出1.51 mg·kg-1；c’11處理下根含磷量最高，達到1.34 mg·kg-1，比CK處理高出1.2 mg·kg-1。方差分析表明，多數處理間有極顯著差異（P＜0.01）。多重比較表明c’21和c’11的葉、根含磷量顯著高于其他處理（P＜0.05），同時在各激素中低濃度處理下根含磷量差異并不顯著，但顯著區別于CK、c’23和c’33處理（P＜0.05）。

3.5 不同激素處理對嫩枝扦插苗根系的影響

各處理根系總根長、根表面積、根體積及平均直徑均顯著高于CK（P＜0.05）（圖8至圖11）。其中c’31扦插苗總根長、根表面積及根體積均為最高，達到15.65 m，170.25 cm2，2.19 cm3，分別高出CK 15.1倍、7.17倍、13.06倍。單因素方差分析、多重比較也發現c’31的根系指標顯著高于其他處理，表明NAA100 mg·L-1處理確實可以有效提高嫩枝扦插苗根系的生長。此外NAA處理下無患子嫩枝扦插苗根系總根長、表面積及根體積也顯著高于GGR6和IAA處理，分析認為NAA相比于IAA和GGR6可更有效促進無患子嫩枝扦插苗根系的生長。

圖8 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗總根長Figure8 Total root length of cuttings treated by different hormones and concentrations

圖9 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根表面積Figure9 Root surface area of cuttings treated by different hormones and concentrations

圖10 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根體積Figure10 Root volume of cuttings treated by different hormones and concentrations

圖11 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根平均直徑Figure11 Mean root diameter of cuttings treated by different hormones and concentrations

4 結論與討論

4.1 無患子嫩枝扦插的生根型

扦插插穗生根過程可概括為：根原始體轉變分生組織，進一步分化為根原基，從而形成不定根[19-21]。按照根原基形成的部位、時間以及形成機制，可將插穗生根類型分為三種，即皮部生根型[21-22]、愈傷組織生根型[23]和中間生根型[24-27]。在無患子科的扦插研究中，宗建偉發現文冠果Xanthoceras sorbifolium生根類型屬于愈傷組織生根[28]。國內外對于無患子嫩枝扦插的相關試驗中鮮見對嫩枝扦插生根機理的研究[11-13]。

本研究發現無患子嫩枝扦插過程中，扦插后25 d出現愈傷組織，33 d出現不定根，40 d后可生長形成健壯苗木。通過不同時期切片觀測，發現扦插后28 d皮下形成根原基，33 d后形成不定根，且生根部位多集中于皮下和愈傷組織中。因此推測無患子嫩枝扦插生根方式屬于皮部生根型和愈傷組織生根型相結合的方式，即中間生根型。

4.2 外源激素處理對無患子嫩枝扦插的影響

研究表明植物營養物質、生長激素、生根輔助因子及抑制劑對插穗生根過程中發生的生理生化變化有著重要影響[28-31]。宗建偉[32]等研究發現IBA 795～820 mg·L-1處理對文冠果扦插苗不同徑級根長、根表面積、根體積等根系指標造成顯著影響，改變根系的形態構成。程水源等試驗表明扦插不定根的形成與扦插苗內酶與內源激素的含量相關[31,33]。

本研究對無患子嫩枝采用了GGR6，IAA及NAA不同濃度進行處理，扦插成活率有不同程度的提高，其中NAA100 mg·L-1處理成活率可達到46.96%，較CK處理高42.24%。同時NAA處理可有效促進插穗根系生長，NAA 100 mg·L-1處理下扦插苗當年總根長（15.65 m）、根表面積（170.25 cm2）及根體積（2.19 cm3）均達到峰值，分別比CK高出15.1倍、7.17倍、13.06倍。不同激素處理也可提高無患子嫩枝扦插苗根、莖、葉生物量和營養成分，其中NAA100 mg·L-1處理下根、葉當年總生物量最高。可見一定濃度激素處理對無患子嫩枝扦插有顯著促進作用，其中NAA相比于GGR6和IAA能更有效促進無患子嫩枝扦插苗成活及生長，本試驗中NAA 100 mg·L-1處理為無患子嫩枝扦插的最優激素處理。

研究同時發現隨著各激素處理濃度提升，無患子嫩枝扦插成活率并無顯著差異，而嫩枝扦插苗的根、葉生物量呈現下降趨勢，推測隨著激素濃度過高可造成一定程度的生長抑制。營養成分也表現出類似規律，隨著各激素濃度的升高，嫩枝扦插苗木根系總根長、根表面積及根體積均呈現下降趨勢，推測隨著激素濃度的升高，表現出對嫩枝扦插苗木根系生長一定的抑制作用。

4.3 無患子嫩枝扦插技術初步總結

通過試驗得出無患子嫩枝扦插繁殖的最佳技術，無患子嫩枝扦插應采集生長健壯母樹當年生枝條制穗，插穗長度10～13 cm，每段插穗保留2～3個芽眼，除去下部所有葉片，保留上部1～2片小葉。采用NAA激素100 mg·L-1浸泡插穗基部1 h。設置自動噴霧裝置保證空氣濕度，并采用遮陽網遮光，避免強光蒸騰失水死亡。結合以上的技術組合，無患子嫩枝扦插成活率可達45%以上。