二甲戊靈對輪葉黑藻生理特性的影響

朱凌 李蒙英 成中芹 謝立群

摘? ? 要：通過測定輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）抗氧化酶（SOD和POD）活性，以及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）和可溶性蛋白含量的變化，比較了不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻生理特性的影響，結果表明，輪葉黑藻經0.10～2.00 mg·L-1二甲戊靈處理2 d后，體內的SOD和POD活性顯著降低，但低濃度二甲戊靈對植物造成的氧化脅迫不足以引起SOD的防御機制形成，因而在短時間內SOD活性快速下降，一段時間后上升;而4.00 mg·L-1二甲戊靈處理后2 d， SOD活性下降不明顯，說明高濃度二甲戊靈引起SOD的防御機制形成，誘導植物體內抗氧化酶活性升高。輪葉黑藻經4.00 mg·g-1處理后8 d，MDA含量出現了較其他試驗組高的峰值;經不同濃度二甲戊靈處理后10 d，1.00 mg·g-1以上使輪葉黑藻Pro含量顯著增加，2.00 mg·g-1以上使可溶性蛋白含量顯著下降，說明1.00 mg·g-1以上濃度二甲戊靈即顯著影響輪葉黑藻的重要生理學指標。

關鍵詞：二甲戊靈;輪葉黑藻;生理特性

中圖分類號：Q178? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.07.003

Abstract： The effects of different concentrations of pendimethalin on the physiological characteristics of Hydrilla verticillata were studied by measuring the activities of antioxidant enzymes （SOD and POD）， the content of MDA， proline （Pro） and soluble protein. The results showed that the activity of SOD and POD in Hydrilla verticillata decreased significantly after the treatment with 0.10 to 2.00 mg·L-1 of pendimethalin for 2 days. However， the oxidative stress caused by low concentration pendimethalin on the plant was not enough to cause the formation of SOD defense mechanism， so SOD activity decreased rapidly in a short time and increased after a period of time. SOD did not decrease significantly at 2 d after treatment with 4.00 mg·L-1，this indicating that high concentration of pendimethalin caused the formation of SOD defense mechanism and induced the increase of antioxidant enzyme activity in the plant. After treatment with 4.00 mg·g-1 for 8 days， the content of MDA in the plant showed a high peak. At different concentrations for 10 days， the Pro increased significantly when the pendimethalin more than 1.00 mg·g-1. And the soluble protein notable decreased when pendimethalin above 2.00 mg·g-1. The results indicated that the concentration of pendimethalin above 1.00 mg·g-1 could significantly affect the important physiological indexes of Hydrilla verticillata.

Key words： pendimethalin; Hydrilla verticillata; physiological characteristics

為提高農作物產量，大量不同品種的農藥被用于控制農業病蟲害和雜草生長。根據國家統計局的數據，2007—2015年我國農藥使用量逐年上升，2012年突破1 800 kg。由于噴施的農藥只有少量停留在作物上發生效用，大部分進入土壤[1]，隨著灌溉或雨水徑流匯入附近河、湖等地表水體，不但污染河、湖水體，也嚴重威脅河、湖水體中多種生物生存[2]。沉水植物作為河、湖等水體中重要的生物群，在增加水體溶解氧、為水生動物提供食物和生長繁殖場所、凈化水體等方面發揮著必不可少的作用，是維持河、湖水體生物多樣性和穩定性最基礎的一環[3-4]。然而，近年來河、湖等地表水環境中沉水植物衰退情況日益嚴重[5]，這種現象除與水體富營養化[6-8]、重金屬污染[9]等因素有關外，與除草劑污染也有著密切的關系，但目前關于除草劑對沉水植物的影響程度仍缺乏廣泛深入的研究報道。

本試驗在實驗室條件下建立良好的沉水植物生長條件，培養輪葉黑藻，以世界第三大除草劑二甲戊靈[10]作為逆境條件，探究二甲戊靈對輪葉黑藻抗氧化酶SOD和POD活性，以及丙二醛MDA、脯氨酸Pro和可溶性蛋白含量的影響，以期為農藥面源污染對沉水植物的影響提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 取樣與試驗條件

試驗用輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）取樣自蘇州大學獨墅湖校區北區池塘，該池塘屬于校方物業部門管理，據了解，在取樣前2個月未施二甲戊靈等除草劑。取樣于2017年6月20日進行。

試驗用二甲戊靈（Pendimethalin）為標準樣品（純度99.8%），購自 Sigma-Aldrich公司。試驗用培養液采用1/6濃度的霍格蘭氏營養液，二甲戊靈處理濃度是指二甲戊樂靈標準樣品加入培養液中配置成的溶液終濃度。根據在自然條件河流中檢測到的二甲戊靈除草劑的濃度范圍[11]，設置試驗組溶液濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，4.00 mg·L-1。將輪葉黑藻用蒸餾水沖洗凈后，放入培養液中馴化培養7 d，再放入含有濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，

4.00 mg·L-1的二甲戊靈試驗組和對照組中，在培養箱培養。培養過程中，溫度為20～25 ℃，光暗時間比為12 h∶12 h，照度為3 600 Lx。各處理每48 h取樣測定1次;連續測定5次。

1.2 生理特性的測定方法

每48 h對輪葉黑藻植株取樣。各樣品用蒸餾水洗凈后用吸水紙吸干，稱取0.5 g，加入少量50 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH值=7.0）在冰浴中研磨成勻漿，再定容至5 mL后轉移至離心管，2 000 rpm離心15 min取上清液， 4 ℃冷藏備用，重復3次。

SOD活性采用氮藍四唑（NBT）光化還原法測定，POD活性采用愈創木酚法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定，上述3種試驗方法參照李合生[12]方法進行，SOD活性測定反應液略有改進，采用的混合反應液見表1。Pro含量的測定，采用磺基水楊酸提取，茚三酮比色法進行[13]?？扇苄缘鞍缀康臏y定，以1 mg·mL-1牛血清蛋白作為標準溶液，采用考馬斯亮藍染料結合法[14]測定。

對試驗組與對照組的SOD和POD活性、MDA、Pro和可溶性蛋白含量的平均數進行新復極差多重比較分析;使用Microsoft Excel軟件進行統計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻SOD和POD活性的影響

處理前，輪葉黑藻葉片內SOD值為（1 233.33±28.87） U·g-1，處理后2 d，各試驗組中SOD活性見表2，隨二甲戊靈濃度從0.10 mg·L-1增加至2.00 mg·L-1，SOD活性相逐步降低，但濃度為4.00 mg·L-1時，SOD活性比其他試驗組高;處理后4 d，4.00 mg·L-1濃度條件下SOD活性出現較大幅度下降，相比處理后2 d下降了24.08%;

而POD值，處理前為（8.78±1.67）（U·g-1），處理后POD均呈上升趨勢（表3），處理后2 d，0.1～2.00 mg·L-1濃度條件下，POD活性與對照組之間差異顯著，但是4.00 mg·L-1濃度條件下，POD活性與對照組之間無顯著差異，結果同SOD活性。

2.2 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻MDA含量的影響

處理前，輪葉黑藻MDA含量為（16.17±2.02）（μmol·g-1），處理后變化情況見表4，對照組MDA的含量基本穩定，但輪葉黑藻經0.10～4.00 mg·L-1二甲戊靈處理后，與對照相比MDA含量總體出現增加趨勢。2.00 mg·L-1和4.00 mg·L-1二甲戊靈濃度處理峰值分別達到23.84和25.99，比其他試驗組的峰高。

2.3 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻Pro含量的影響

輪葉黑藻經不同濃度二甲戊靈處理后10 d，低濃度處理組（0.10，0.20和0.50 mg·L-1）的脯氨酸（Pro）含量與對照組差異不顯著（圖1），高濃度處理組（1.00，2.00和4.00 mg·L-1）Pro含量顯著高于對照組。

2.4 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻可溶性蛋白含量的影響

輪葉黑藻經不同濃度二甲戊靈處理后10 d，隨著二甲戊靈處理濃度的增加，輪葉黑藻中可溶性蛋白含量呈下降趨勢，高濃度處理組（2.00 mg·L-1和4.00 mg·L-1）的可溶性蛋白含量有較大程度下降，與對照組之間呈顯著差異。

3 結論與討論

抗氧化酶SOD和POD是植物體中重要的保護機制基礎[15-16]，本試驗結果表明，當輪葉黑藻在0.10～2.00 mg·L-1二甲戊靈處理時，可能該濃度范圍尚未觸發植物細胞合成SOD的保護機制，反而因為二甲戊靈的處理造成超氧自由基增多，影響了SOD的正常代謝，導致SOD活性降低;而4.00 mg·L-1濃度處理條件下，二甲戊靈的強烈脅迫誘使植物細胞加快合成SOD，從而該濃度條件下的SOD活性較高;但細胞合成SOD的能力是有限的，不足以將二甲戊靈作用所產生的超氧自由基清除到危害下限內，SOD活性在處理后4 d也出現下降。趙士誠等[17]在鎘脅迫對植物SOD酶活影響的研究中，也發現用5 μmol·L-1鎘處理植株，SOD活性大部分時間低于對照和兩個高鎘處理，說明低濃度鎘對植物造成的輕微氧化脅迫不足以引起SOD防御機制的形成。但是需要強調的是，酶液樣品的SOD活性在4 ℃保存條件下的變化仍然明顯[18]，故測定的試驗結果的橫向比較有待后續進一步研究。

MDA是膜脂過氧化物最終分解產物，積累越多表明組織的保護能力越弱[19-20];當處理二甲戊靈濃度增大到4.00 mg·L-1，可能是由于植物體內的SOD和POD的活性不能持續保持在較高的水平，導致對膜質過氧化作用加強，細胞膜遭到進一步破壞，進而出現膜質氧化產物MDA含量的升高[21]。

脯氨酸Pro是植物體內維持滲透壓的重要物質之一，同時，作為植物體內的一種貯氮機制，可以防止游離氨的積累，起到對植物的保護作用[21]，本試驗表明，二甲戊靈在較高濃度下對Pro影響較大，這與Foolad和Jones[22]的研究吻合;可溶性蛋白含量在二甲戊靈濃度2.00 mg·L-1以上處理10 d后顯著降低，同樣表明植物體生長發育受到抑制的程度顯著升高[23-24]。

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