兒童肺炎支原體肺炎外周血miRNA-492的表達

孫旦　李玉琴　丁瑩　雷小麗　駱亞麗　周衛芳

【摘要】 目的 探討miRNA-492在兒童支原體肺炎中的作用，進一步了解支原體感染的免疫致病機制。方法 選取2014年3月至2015年6月期間住院治療，確診為肺炎支原體肺炎患兒23例作為實驗組（MPP組），同時期健康兒童20例作為對照組（NC組），采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6，RT-qPCR法檢測HMGB1及miRNA-492的表達量，分析兩組實驗室檢查結果、免疫球蛋白水平及淋巴細胞亞群分布，探討miRNA-492與TNF-α、IL-6、HMGB1及其他實驗室指標的相關性。結果 肺炎支原體肺炎組患兒外周血miRNA-492、TNF-α、IL-6、HMGB1的表達水平均高于健康對照組（P<0.05）。MPP組miRNA-492與Neut、Lymph、CRP、AST、LDH、HBDH、PA、IgA、IgG、CD3+CD4+百分比、NK 細胞百分比、CD19+CD23+百分比、TNF-α、IL-6均無明顯相關性（P>0.05），與HMGB1呈負相關（P<0.01）。結論 miRNA-492、TNF-α、IL-6及HMGB1在肺炎支原體肺炎感染和發病中起一定作用，作用機制可能不同。

【關鍵詞】 肺炎支原體肺炎;miRNA-492;TNF-α;IL-6;HMGB1

中圖分類號：R725.6? ?文獻標志碼：A? ?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.06.006

【Abstract】 Objective To investigate the role of miRNA-492 in children with mycoplasma pneumoniae pneumonia and to further understand the immune pathogenic mechanism of mycoplasma infection.Methods 23 children diagnosed with mycoplasma pneumonia during hospitalization from March 2014 to June 2015 were selected as experimental group（MPP group），and 20 healthy children in the same period were selected as control group（NC group）.And then，TNF-α and IL-6 were detected by ELISA，and the expression of HMGB1 and miRNA-492 by RT-qPCR.The results of laboratory examination，immunoglobulin levels and the distribution lymphocyte of subsets in the two groups were analyzed.In addition，correlation between miRNA-492 and TNF-α，IL-6，HMGB1 and other laboratory indexes was explored.Results The expressions of microRNA492，TNF-α，IL-6 and HMGB1 in peripheral blood of children with mycoplasma pneumoniae pneumonia were higher than those of healthy control group（P<0.05）.In the MPP group，miRNA-492 was not obviously correlated with TNF-α，IL-6，Neut，Lymph，CRP，AST，LDH，HBDH，PA，IgA，IgG and the percentages of CD3+CD4+，NK cell and CD19+CD23+（P>0.05），but it was negatively correlated with HMGB1（P<0.01）.Conclusion MiRNA-492，TNF-α，IL-6 and HMGB1 play certain roles in the immune pathogenesis of mycoplasma pneumoniae pneumonia，but their mechanisms of action may be different.

【Key words】 mycoplasma pneumoniae pneumonia;miRNA-492;TNF-α;IL-6;HMGB1

肺炎支原體（MP）是兒童社區獲得性肺炎的常見病原菌，體液免疫、細胞免疫和細胞因子在肺炎支原體肺炎（MPP）發病機制中起到重要作用[1～4]。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，miRNA-492是靈長類動物特有的miRNA[5]。miRNA-492可調控多種蛋白表達，在腫瘤發生和轉移、胰島素抵抗、自身免疫等生物進程中起到重要作用，在支原體感染中鮮有文獻報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2014年3月至2015年6月期間在蘇州大學附屬兒童醫院住院治療，確診為肺炎支原體肺炎患兒23例作為研究對象（MPP組），同期健康體檢兒童20例作為對照（NC組），入院后采集2 mL外周血，ELISA法檢測TNF-α、IL-6，RT-qPCR法檢測HMGB1及miRNA-492的表達量，回顧性分析其實驗室檢查、免疫球蛋白水平檢測及淋巴細胞亞群檢測。其中MPP組患兒男14例，女9例，平均年齡（6.72±2.93）歲;NC組健康兒童男11例，女9例，平均年齡（6.42±2.67）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05）。MPP組所有入選病例符合肺炎支原體肺炎診斷標準[6]，排除常見的病毒、衣原體、結核菌的感染以及腫瘤發生轉移、胰島素抵抗、自身免疫性疾病。NC組符合下列條件：同時期內無器質性疾病、3個月內無急性感染性疾病史的健康兒童。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有病例入院后次日清晨采集空腹抗凝血2 mL，2小時內4℃，2500 rpm離心10分鐘，吸取上層黃色血漿-80℃凍存。剩余血細胞按紅細胞裂解法分離獲得白細胞，加入1 mL Trizol吹打混勻得到白細胞Trizol混合液，-80℃凍存備用。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-492的表達 23例MPP組及20例NC組的白細胞Trizol混合液冰上溶解，提取并純化RNA，分光光度計測定RNA的質量和濃度。miRNA-492以U6為內參，HMGB1以β-actin為內參，按照灝勤生物公司miRNA/mRNA實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒說明書測定樣本中miRNA-492及HMGB1的表達，采用相對表達量2-△△Ct法比較各基因的表達差異。

1.2.3 流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群 淋巴細胞亞群的檢測運用BD FACSCalibur公司流式細胞儀進行多參數分析。

1.2.4 ELISA 檢測 采用聯科生物技術公司 ELISA試劑盒檢測血漿 TNF-α、IL-6表達水平，具體操作方法嚴格按照說明書步驟進行。

1.3 統計學方法 統計學分析采用SPSS 17.0軟件包，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，非正態分布計量資料以中位數（四分位數間距）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。計數資料以百分比或率表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。相關性分析采用Spearson秩相關分析。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結? 果

2.1 MPP組患兒與NC組兒童實驗室指標比較 兩組兒童實驗室指標比較共有12項指標差異有統計學意義（P<0.05或0.01）。見表1。

2.2 MPP組患兒與NC組兒童miRNA-492及細胞因子比較 MPP組患兒外周血miRNA-492、TNF-α、IL-6、HMGB1的表達水平均高于NC組兒童，兩者之間差異具有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 miRNA-492水平與差異表達的實驗室指標及細胞因子相關性 MPP組miRNA-492與Neut、Lymph、CRP、AST、LDH、HBDH、PA、IgA、IgG、CD3+CD4+百分比、NK 細胞百分比、CD19+CD23+百分比、TNF-α、IL-6均無明顯相關性（P>0.05），與HMGB1呈負相關（P< 0.01）。見表3。

3 討? 論

肺炎支原體肺炎曾被當作一種自限性疾病，并不受到重視。但近年來，難治性肺炎支原體肺炎及支原體肺炎造成的肺外并發癥也可能給患者造成嚴重的組織器官損傷;同時也有研究表明，肺炎支原體的感染可能與哮喘發病密切相關[7]。本組支原體肺炎患兒外周血CRP、中性粒細胞數等炎性指標明顯增高，淋巴細胞數降低、前白蛋白減少明顯，考慮與MP感染后引起機體較強的炎癥反應有關。MP感染后易引起肺外損傷，其中以肝功能及心臟損傷最為多見。本組支原體肺炎患兒外周血HBDH、LDH、AST增高，心肌酶的增高考慮與MP感染導致的免疫激活相關。

免疫機制在肺炎支原體的感染和MPP發病過程中起到了重要的作用，目前尚未完全明了。一方面，肺炎支原體可在體內誘發體液免疫應答，刺激B細胞產生免疫球蛋白，形成免疫復合物。另一方面，肺炎支原體的表面抗原與人體多種組織器官表面抗原相似，還可改變部分人體細胞表面抗原表達，誘發免疫細胞對自身組織的攻擊[8]，導致被感染者免疫紊亂。

TNF-α是機體重要的內源性炎癥因子，文獻報道TNF-α參與重癥肺炎所致的肺損傷[9]，本研究結果顯示MPP組患兒的TNF-α水平高于NC組，提示TNF-α參與了肺炎支原體肺炎的發病過程。IL-6水平增高是最早出現的感染指標。IL-6是MPP炎癥反應中的重要細胞因子，在免疫應答的早期即發揮重要作用[10]。本研究結果顯示MPP組患兒的IL-6高于NC組，提示IL-6參與了肺炎支原體肺炎的發病過程。HMGB1是一種保守的非組蛋白核蛋白，尹力等人[11]研究顯示HMGB1在肺炎患者血液中高度表達（P<0.05），可能提示疾病的嚴重程度。本研究結果顯示MPP患兒血漿HMGB1的含量明顯高于健康對照組，提示HMGB1參與了肺炎支原體肺炎的發病過程。

miRNA作為近年來備受關注的一類內源性非編碼小RNA，在多種生物學進程中發揮重要作用。本課題組前期研究應用miRNA芯片技術比較MPP組與NC組兒童外周血血漿中miRNA的表達譜，篩選出26條差異表達的miRNAs，19條miRNAs上調，7條miRNAs下調，提示miRNAs參與機體對肺炎支原體的免疫應答反應，并對miRNA-492 及miRNA-222-3P進行了驗證[12]。

miRNA-492位于12q22染色體上，序列為AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU，是靈長類動物特有的miRNA，在腫瘤的發生、生長、轉移及胰島素抵抗等生物過程中起重要作用，同時，由于miRNA在組織細胞內和外周血液系統中均有存在，并且不受內源性RNA酶的影響，穩定性較好，因此，亦有文獻報道miRNA-492可作為生物標記物，用于疾病的診斷中[13]。但在支原體肺炎的診斷敏感性和特異性未做ROC曲線分析，因樣本量較小，且除了健康對照組以外還需要做一些病毒性、細菌性肺炎標本作為對照才有意義。miRNA-492在感染性疾病的研究甚少，RT-PCR結果顯示，與健康對照兒童相比，miRNA-492在肺炎支原體患兒的外周血中水平顯著升高，推測miRNA-492在肺炎支原體肺炎發病過程中起到一定作用。然而，本研究將miRNA-492水平與肺炎支原體肺炎患兒差異表達的實驗室指標及炎癥因子進行相關性分析，發現miRNA-492與HMGB1呈負相關，與其他指標無相關性。究其原因，可能是由于miRNAs的調控作用是一系列非常復雜的網絡，具有較強的時間性和空間性，所以，miRNA-492和肺炎支原體肺炎患兒的相關實驗室指標、TNF-α、IL-6的調節并不具有明顯相關性，而HMGB1作為晚期炎癥因子在炎癥反應中常常出現得比較晚，在支原體感染中的研究也極少，且本次研究病例較少，生物學信息分析miRNA-492下游的靶基因較多，是否存在哪一個靶基因調節HMGB1的表達在今后的實驗中有待進一步研究。