豆制品轉基因檢測中不同DNA提取方法的比較

孫夢夢　黃歡歡　沈曉芳　龐月紅

摘要：高品質的DNA是分子生物學研究的關鍵，大豆及豆制品中含有較多的蛋白質、酚類、糖類和脂類物質，從中提取高品質的DNA比較困難。擬采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS）法、改良CTAB法、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法、SDS-聚乙烯吡咯烷酮（簡稱SDS-PVP）法和TIANGEN試劑盒法對大豆MON 89788、小黃豆、豆腐及大豆油中的DNA進行提取，對試驗過程中的蛋白酶K、RNA酶A的濃度進行優化，并對DNA濃度及純度進行綜合分析。結果表明，對于大豆MON 89788、小黃豆和豆腐，用SDS法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右，DNA產量最高，用改良CTAB法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右，用TIANGEN試劑盒法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.75左右，2種方法的DNA產量均比SDS法低，而用 SDS-PVP 法與CTAB法提取的DNA含有較多雜質。綜合分析可知，大豆油的最佳DNA提取方法為改良CTAB法。

關鍵詞：大豆MON 89788;豆制品;DNA提取;瓊脂糖凝膠電泳

中圖分類號： S188? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0047-04

大豆及豆制品是全球食用油及植物蛋白的重要來源，為了提高大豆的產量，滿足人們對大豆的需求量，科研人員采用基因工程與分子輔助育種方法，培育了一些優質、高產和抗逆的轉基因大豆品種[1]。據報道，我國的大豆需求量從1990年的1 100萬t增加到2015年的9 300萬t，但是我國的大豆總產量遠不能滿足國內需求，從1996年起，我國成為大豆的凈進口國，進口量從當年的111萬t持續增加到2015年的8 169萬t[2]。目前我國進口的大豆主要來自美國、巴西、阿根廷這3個國家，而這3個國家出口的大豆基本上為轉基因大豆[3]。由于公眾對轉基因食品的食用安全性和生態安全性認識存在爭議，部分國家和地區對轉基因作物提出了標簽化管理的要求。為保障廣大消費者的知情權和選擇權，建立準確、快速的轉基因檢測方法至關重要[4-5]。基因檢測技術，尤其是聚合酶鏈式反應（PCR）[6-9]，已被廣泛用于食品生物安全檢測等領域。然而，基因組DNA的提取是基因檢測技術研究的基礎[10]，由于大豆及豆制品中含有較多的多糖、酚類物質，在提取DNA時首先要考慮如何去除多糖、多酚等干擾PCR效果的物質，從而在某種程度上增加了大豆DNA提取的困難程度[11-12]。因此，如何從大豆及豆制品中獲得高質量的DNA是后續食品檢測成功與否的關鍵[13-15]。

本試驗采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS）法、改良十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法、CTAB法[16-18]、SDS-聚乙烯吡咯烷酮（簡稱SDS-PVP）法及TIANGEN試劑盒法提取大豆MON 89788、小黃豆、豆腐、大豆油中的DNA，通過比較濃度、純度等指標，篩選出適合大豆及豆制品DNA提取的方法，以期為后續的分子生物學分析及標簽化管理奠定基礎。

1 材料與方法

本試驗于2016年11月至2017年5月在江南大學食品學院食品質量與安全中心進行。

1.1 材料與試劑

小黃豆、豆腐、大豆油均購于江蘇省內的歐尚超市;MON 89788大豆為轉基因大豆品種，購于AOAC（美國分析化學家協會）。

CTAB提取緩沖液（pH值為8.0）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，簡稱PBS）、SDS提取/裂解緩沖液、TE緩沖液（pH值為8.0）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，簡稱EDTA）溶液（pH值為 8.0，0.5 mol/L）、改良CTAB提取緩沖液，均由國藥集團化學試劑有限公司提供;核酸序列和marker，購于生工生物工程（上海）股份有限公司;TIANGEN試劑盒，購于北京TIANGEN公司;蛋白酶K、RNA酶A，購自碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外分光光度計，日本島津公司;T 100TM PCR儀，美國Bio-Rad公司;Tanon 6600全自動凝膠成像儀，上海天能公司;高速冷凍離心機，美國Thermo公司;TGL-16G高速離心機，上海安亭公司;SHA-B恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.3 DNA提取方法

根據所用方法配制相應的抽提緩沖液，其中SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法參照農業部1485號公告-4-2010《轉基因植物及其產品成分檢測DNA提取和純化》，TIANGEN試劑盒按照說明書進行試驗操作，將提取出的DNA放入冰箱，待后續檢測使用。

1.4 酶的優化

以大豆MON 89788為樣品，對不同DNA提取方法中蛋白酶K、RNA酶A的濃度進行優化，TIANGEN試劑盒按說明書進行操作不作此優化，用紫外分光光度法檢測DNA的濃度和純度，得出蛋白酶K、RNA酶A的最佳濃度。

1.5 DNA的濃度和純度

用紫外分光光度法鑒定DNA的濃度、純度：取10 μL DNA提取液稀釋300倍，測定試驗樣品在260、280 nm下的D值，用D260 nm/D280 nm值判斷各樣品中的DNA純度，并計算DNA的濃度。DNA濃度計算公式如下：

DNA質量濃度（ng/μL）=50 ng/μL×D260 nm×稀釋倍數。

根據SN/T 1195—2003《大豆中轉基因成分的定性PCR檢測方法》，選擇不同提取方法及不同樣品的基因組DNA對大豆的Lectin基因進行核酸定性PCR擴增。PCR反應循環參數：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共40個循環;72 ℃ 7 min，4 ℃保存。Lectin基因的PCR引物信息見表1。

吸取5 μL經PCR擴增的DNA提取液，與2 μL上樣緩沖液充分混合，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳時間為 40 min，電壓為100 V，電泳結果在紫外燈下進行觀察、拍照。吸取5 μL稀釋100倍的DNA提取原液，重復上述步驟。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶K、RNA酶A的濃度優化

大豆及豆制品中的蛋白質含量豐富，蛋白酶K具有消化包圍靶DNA的蛋白質的作用，可以使DNA更好地被釋放出來，所以本試驗優化了蛋白酶K的添加濃度。如圖1所示，不同濃度的蛋白酶K對提取的DNA純度有較大影響，在不添加蛋白酶K或蛋白酶K濃度為5 mg/mL時，D260 nm/D280 nm值在1.7以下，說明蛋白質污染嚴重;當蛋白酶K濃度越來越大時，D260 nm/D280 nm值越來越接近1.8;當蛋白酶K的濃度超過 20 mg/mL 后，D260 nm/D280 nm值再次降至1.7以下，說明又存在蛋白質污染。出現這些結果的原因，是由于蛋白酶K本身也是蛋白質，如果加入濃度過高，也會造成蛋白質污染。所以，本試驗選擇15 mg/mL為最佳蛋白酶K濃度。

在DNA的提取過程中如果有RNA污染，會影響試驗結果，RNA酶A對RNA有水解作用，本試驗優化了RNA酶A的添加濃度。如圖2所示，當不添加RNA酶A或RNA酶A濃度≤4 mg/mL時，D260 nm/D280 nm值在1.9以上，說明RNA污染嚴重;隨著RNA酶A的濃度增大，D260 nm/D280 nm值越接近1.8; RNA酶A濃度在達到8 mg/mL之后，隨著RNA酶A濃

度的增大，D260 nm/D280 nm值趨于穩定。所以，本試驗選擇 8 mg/mL 為最佳RNA酶A濃度。

2.2 5種方法提取不同樣品DNA純度、濃度的鑒定

用SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法和TIANGEN試劑盒法提取大豆MON 89788、小黃豆、豆腐以及大豆油中DNA的純度如圖3所示。當D260 nm/D280 nm在1.7以下時，表示有蛋白質污染，當D260 nm/D280 nm在1.9以上時，表示有RNA污染，D260 nm/D280 nm在1.8左右時，表示得到高純度的DNA[19]。對大豆MON 89788及小黃豆樣品采用SDS法、改良CTAB法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值在1.8左右， 表

明用SDS法、改良CTAB法提取大豆DNA的質量好，純度較高。豆腐屬于深加工產品，在加工過程中經過熱處理并加入不同物質等，會使DNA發生不同程度的降解，所以在5種方法下，DNA的提取純度均有所下降，用SDS法提取的DNA的D260 nm/D280 nm值為1.8，其他方法的D260 nm/D280 nm值為1.7左右，表明SDS法的提取效果最好。大豆油經過較為復雜的精煉過程，其中的DNA在一定程度上損失了，使得大豆油DNA的提取較困難，因此大豆油DNA最適合用改良CTAB法提取。

由圖4可以看出，用5種方法提取大豆MON 89788、小黃豆、豆腐DNA濃度的結果顯示，SDS法提取的DNA濃度明顯優于其他方法，SDS-PVP法的效果最差。這主要由于SDS是一種陰離子去污劑，在高溫條件下能裂解細胞，使染色體離析、蛋白變性，同時，SDS會與蛋白質、多糖結合成復合物，釋放出核酸，使得DNA得率較高，通過三氯甲烷及酚溶液抽提、鹽溶液濃度增加去除雜質，能夠得到高質量的DNA。PVP是高分子表面活性劑，PVP的加入增加了提取反應體系中的黏稠性，部分DNA被吸附從而使提取的DNA含量降低。5種方法提取的豆腐DNA濃度明顯比大豆MON 89788、小黃豆樣品的低，這是由于豆腐在深加工過程中，部分DNA被破壞而損失。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

選擇大豆Lectin基因驗證所提取的DNA是否能夠滿足后續PCR檢測的需要。對不同樣品的不同提取方法提取得到的DNA進行Lectin基因PCR擴增，如果提取得到的DNA中有蛋白質、多糖、RNA等雜質污染，這些雜質就會遏制PCR反應，出現假陰性結果[20]。圖5為其中最佳的2種方法（SDS法和改良CTAB法）的PCR產物凝膠電泳結果，可以看出，模板DNA都擴增正常，說明所提取的DNA沒有被污染，純度較高。由于不同試驗樣品的DNA都能夠擴增出比較鮮明、條帶

大小約為118 bp的DNA條帶，與所需終產物的片段大小一樣，結論可靠，因此可知，SDS法和改良CTAB法可以用作DNA的提取方法。

由圖6的2種方法（SDS法和改良CTAB法）對不同樣品的基因組DNA完整性凝膠電泳結果可以看出，使用SDS法、改良CTAB法都能得到DNA條帶，用SDS法提取的大豆MON 89788、小黃豆和豆腐的基因組DNA條帶更清晰，更完整。由于大豆油的提取效果較差，因此基因組DNA條帶不清晰。此外，1號點膠孔處亮度較高，表明有少許蛋白質污染。綜上可以看出，SDS法的提取效果最佳。

3 總結與展望

本試驗以大豆MON 89788、小黃豆、豆腐、大豆油為樣品，研究SDS法、改良CTAB法、CTAB法、SDS-PVP法及TIANGEN試劑盒法提取DNA的效果，旨在選出簡單、快捷、高品質的DNA提取方法。試驗結果顯示，對于大豆及豆腐樣品，SDS法提取DNA的濃度及純度最佳，改良CTAB法和TIANGEN試劑盒法的效果次之;如果對DNA純度和濃度要求不高且需要快速提取，可以考慮TIANGEN試劑盒法;對于大豆油DNA提取的最佳方法為改良CTAB法。在DNA提取過程中應該盡量簡化操作步驟，這樣可以減少對基因組的損傷和操作過程中污染的可能性。目前，適合大豆油DNA提取的方法較少且提取的DNA產量不高，有待于進一步探索更有效的DNA提取方法。

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