1株拮抗鏈格孢的芽孢桿菌的篩選鑒定和抑菌效果

劉偉　王多文　何彩　李強　史星雲　劉鵬

摘要：以鏈格孢（Alternaria spp.）為靶標菌從農田土壤中分離到1株芽孢桿菌。通過形態學特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等對菌株進行鑒定。結果表明，菌株LKYLW-1為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus，GenBank登錄號為MF375905）;對鏈格孢的抑菌帶寬為15.8 mm;采用菌絲生長抑制法、孢子萌發法測定LKYLW-1的抑菌作用，發現菌株LKYLW-1代謝產物對鏈格孢絲有致畸作用;菌株LKYLW-1發酵液對孢子萌發抑制率為96.60%;EC50為6.93 mL/L;飽和度為25%;硫酸銨獲得的抑菌物質對鏈格孢的抑菌活性較高，抑菌圈直徑達42.01 mm。

關鍵詞：芽孢桿菌;抑菌活性;拮抗;鏈格孢屬靶標真菌;形態學特征;生理生化分析;16S rDNA序列分析

中圖分類號： S476;S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0091-03

多種作物的黑斑病是由鏈格孢屬真菌（Alternaria spp.）引起的[1]，鏈格孢屬真菌會導致作物產量和品質受到嚴重影響，鏈格孢屬真菌同時也是蔬菜貯藏過程中的主要病害菌，能引起多種瓜果、蔬菜的腐敗，造成了巨大的經濟損失[2]。使用農藥能暫時控制黑斑病的大面積傳播，然而其副作用也引起了人們的重視。

生物防治因其對人畜安全、環境兼容性好、而且不易產生抗藥性而倍受關注。王繼華等從冷凍菌種甘油中分離到1株芽孢桿菌，能產生抑制鏈格孢真菌的物質[3];趙陽國等從土壤中分離出1株枯草芽孢桿菌，該菌對農林業危害真菌鏈格孢菌具有強烈的抑制作用[4]。芽孢桿菌防治植物病害的作用機制主要有與病原菌競爭營養和生態位點、分泌抗菌物質抑制病原菌的生長以及激發植物系統抗病性[5]。本研究通過形態學特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等方法，鑒定出1株從農田土壤中分離到的芽孢桿菌，能夠強烈抑制鏈格孢屬真菌的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

供試鏈格孢：本研究用菌由甘肅省釀酒葡萄苗木快繁工程技術研究中心葡萄病理實驗室保存、提供。

土壤樣品：從甘肅省武威市林業科學研究院采集農田土壤30份。

培養基：溶菌肉湯（LB）固體培養基用于分離和保存分離的芽孢桿菌;LB液體培養基用于發酵分離芽孢桿菌;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基用于對峙培養。

試驗時間：2016年8月。

1.2 方法

1.2.1 土壤拮抗芽孢桿菌的分離和篩選 芽孢桿菌的分離采用稀釋涂布法[6]。將采集的土樣稱取10 g，加入裝有 90 mL 無菌水并放有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，80 ℃水浴30 min，再充分振蕩30 min，10倍倍比稀釋，涂布分離。純化的細菌經革蘭氏染色和芽孢染色，顯示菌體呈桿狀、產芽孢、G+的分離物為芽孢桿菌。將分離得到的芽孢桿菌進行編號，觀察菌落形態。

采用平板對峙法進行拮抗芽孢桿菌的篩選，將已培養3 d的鏈格孢用5 mm打孔器打孔，將菌餅移到PDA培養基中央，28 ℃培養24 h后，在離真菌等距離的四周接上待測芽孢桿菌，28 ℃培養4 d后，測量抑菌帶的寬度，篩選效果最好的1株芽孢桿菌進行研究[7-8]。

1.2.2 拮抗芽孢桿菌的抑菌活性測定 對鏈格孢菌絲影響的研究采用平板對峙法[9]，在PDA平板中央接鏈格孢菌餅，在距離中心3 cm的兩側接種培養48 h且生長良好的拮抗芽孢桿菌，28 ℃倒置培養4 d。觀察靠近芽孢桿菌抑菌圈邊緣菌絲的生長情況，以遠離拮抗芽孢桿菌的邊緣菌絲為對照，顯微觀察菌絲的生長情況。

拮抗芽孢桿菌無菌發酵濾液的制備：將發酵液經 10 000 r/min 離心過濾，0.22 μm濾膜過濾除菌得到無菌發酵液。將鏈格孢孢子制備成孢子懸浮液（400倍顯微鏡下，每個視野中可看到20個孢子），將制備好的拮抗芽孢桿菌無菌發酵液與病原菌孢子配制成0、50、100、200、500 mL/L系列濃度的孢子懸浮液，以清水為對照，每個處理3次重復。28 ℃恒溫培養8～10 h，檢查對照處理的孢子萌發情況（以孢子芽管長度大于孢子短半徑時判為萌發），孢子萌發抑制率=（對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發 率×100%[10-11]。

1.2.3 拮抗芽孢桿菌的鑒定

1.2.3.1 菌體形態、培養特征觀察及生理生化指標測定參照柳鳳等的方法[12]。

1.2.3.2 16S rDNA基因序列測定及其系統進化樹的構建參照Todorov等的方法[13] 提取細菌基因組DNA為模板，以7f（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540r（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]為上、下游引物，擴增菌株的16S rDNA。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往該公司進行序列測定，測序結果用Blast軟件在GenBank中進行同源性比較，并提交注冊登錄號，進行序列分析。

1.2.4 拮抗芽孢桿菌抑菌物質的提取 將拮抗芽孢桿菌LKYLW-1接種到LB液體培養基中，對照為LB液體培養基，28 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，10 000 r/min離心 20 min，去菌體，加入不同質量濃度的硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別為10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，4 ℃下靜置沉淀24 h，棄上清，沉淀用25 mmol/L磷酸緩沖液溶解，透析脫鹽后與鏈格孢對峙培養，5 d后用濾紙片法[14]測定抑菌圈大小。

1.2.5 數據分析 采用SPSS 16.0軟件、Duncans方法對所有數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗芽孢桿菌的篩選結果

2.1.1 拮抗芽孢桿菌的篩選 從甘肅省武威市林業科學研究院農田30份土壤中，分離得到151株芽孢桿菌。經鏈格孢篩選后，得到抗鏈格孢活性較強的芽孢桿菌3株，其中LKYLW-1菌株對鏈格孢的拮抗活性較好，抑菌帶寬為 15.8 mm，如圖1所示。故后續試驗均以LKYLW-1菌株為拮抗菌。

2.2 LKYLW-1的抑菌活性

2.2.1 對鏈格孢菌絲生長的影響 圖2結果顯示，對照菌絲生長細長而均勻，細胞結構較為清晰，并無膨大畸形現象（圖2-a）。LKYLW-1菌株主要使菌絲體膨大變粗，生長畸形，菌絲頂端和分枝處較為膨大;菌絲分枝增多，粗而短;菌絲體內部細胞原生質體分布不均勻，濃縮成不規則體，部分菌絲內有原生質流出形成空殼的現象（圖2-b）。

2.2.2 對鏈格孢孢子萌發的抑制作用 由圖3可知，無菌發酵液對孢子萌發有明顯的抑制作用，孢子萌發抑制率為 96.60%，EC50為6.93 mL/L。

2.2.4 LKYLW-1菌株的鑒定

2.2.4.1 菌株LKYLW-1培養性狀、形態學特征及生理生化特征 在LB固體培養基上，LKYLW-1菌落呈乳白色、不透明、菌落光滑、中間凹陷、邊緣隆起。透過電鏡顯示 LKYLW-1 呈桿狀，長約2 μm，革蘭氏陽性，周生鞭毛，芽孢呈橢圓形（圖4）。將菌株LKYLW-1的形態特征和生理生化特性（表1）與《常用細菌系統鑒定手冊》中有關細菌的描述進行比較，確定此菌株為芽孢桿菌屬，菌株基本可以確定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。

2.2.4.2 16S rDNA序列分析 以LKYLW-1基因組DNA為模板，用引物7f和1 540r進行PCR擴增，測得該菌株的16S rDNA核苷酸序列長度為1 492 bp，GenBank登錄號為MF375905。將該序列與GenBank中的相關數據進行相似性分析，結果表明，與親緣關系相近的前100個序列全為芽孢桿菌屬;前20個序列中， 有13株為萎縮芽孢桿菌菌株;且菌株LKYLW-1與它們都具有99%以上的同源，其中與萎縮芽孢桿菌（登錄號：CP022653.1、CP021500.1、KR085882.1、CP011802.1、CP010778.1、CP007640.1、KF751643.1、CP002207.1）的同源性最高，達到了100%。綜合生理生化特征將其鑒定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）LKYLW-1。

2.2.5 LKYLW-1菌株的抑菌物質對鏈格孢的抑菌活性 由表2可知，菌株LKYLW-1能夠分泌胞外抑菌物質，在硫酸銨飽和度≥35%時無沉淀析出，即對鏈格孢無抑菌活性，而硫酸銨飽和度為10%～30%時，獲得的抑菌物質對鏈格孢均具有抑菌活性，但抑菌活性不同。其中，硫酸銨飽和度為25%時獲得的抑菌物質抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最高，抑菌圈直徑達42.01 mm（圖5）。

3 結論與討論

本研究從農田土壤中分離篩選出拮抗芽孢桿菌，一方面增大了成功篩選出拮抗菌的可能性，另一方面將其施用于作物時無毒無害。芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一種非致病性細菌，能產生多種抗菌物質，其中大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽性菌，有些還能抑制霉菌、革蘭氏陰性菌和酵母[15]。本研究中LKYLW-1菌株在距離鏈格孢中心3 cm的2側接種培養48 h后，可使菌絲體膨大變粗，生長畸形;菌絲體內部細胞原生質體分布不均勻，濃縮成不規則體，部分菌絲內有原生質流出形成空殼的現象，最終可能會導致菌絲不能正常分化產生孢子，影響其繁殖，不過抑菌機制還需要進一步研究。

本研究的目的是通過篩選找到對鏈格孢有明顯拮抗作用的菌株，并對其進行初步研究，拓寬了鏈格孢拮抗菌的篩選范圍，為今后鏈格孢引起的病害生物防治奠定了基礎。今后將對菌株LKYLW-1進行深入研究，包括發酵條件優化，拮抗蛋白的分離、提取，以及拮抗蛋白的純化測序等，使其商品化生產。

參考文獻：

[1]王岱峰. 南美洲首次發現由番薯生鏈格孢引起的甘薯葉斑病和莖枯病[J]. 園藝與種苗，1995（6）：44-45.

[2]曹健康. 杏采后黑斑病潛伏侵染時期、機制及控制[D]. 蘭州：甘肅農業大學，2002.

[3]王繼華，李 晶，楊茹冰，等. 一株拮抗鏈格孢（Alternaria spp.）抗生素產生菌研究[J]. 哈爾濱工業大學學報，2006，38（9）：1594-1596，1604.

[4]趙陽國，任南琪，程玉鵬. 一株芽孢桿菌的分類鑒定及其抑菌產物特性[J]. 微生物學雜志，2006，26（6）：1-6.

[5]Lugtenberg B，Kamilova F. Plant-growth-promoting rhizobacteria[J]. Annual Review of Microbiology，2009（1）：541-556.

[6]Niemann H，losekann T，de Beer D，et al. Novel microbial communities of the Haakon Mosby mud volcano and their role as a methane sink[J]. Nature，2006，443（5227）：854-858.

[7]周棱波，黎定軍，陳 武，等. 煙草赤星病拮抗菌的篩選[J]. 湖南農業科學，2011（3）：100-101，104.

[8]儲慧清，方敦煌，孔光輝，等. 拮抗菌AM6代謝產物防治煙草赤星病試驗[J]. 煙草科技，2004（4）：42-44.

[9]李愛榮，安德榮. 兩株生防熒光假單胞桿菌的室內篩選試驗[J]. 微生物學雜志，2003，23（4）：11-13.

[10]慕立義，吳文君，王開運. 植物化學保護研究方法[M]. 北京：中國農業出版社，1997.

[11]吳文君. 植物化學保護實驗技術指導[M]. 陜西：陜西科學與技術出版社，1998.

[12]柳 鳳，歐雄常，何 紅，等. 紅樹內生菌AmS2菌株對芒果炭疽病菌的抑制作用[J]. 植物保護學報，2010，37（5）：453-458.

[13]Todorov S D，Meincken M，Dicks L M T. Factors affecting the adsorption of bactcriocins ST194BZ and ST23LD to Lactobacillus sakei and Enterococcns sp.[J]. Journal of General and Applied Microbiology，2006，52：159-167.

[14]單文榮，李俊霞，劉花粉. 濾紙片法篩選不同活性物對棉花黃萎病菌抑制效果研究[J]. 中國農學通報，2010，26（19）：285-289.

[15]劉 靜，王 軍，姚建明，等. 枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J]. 微生物學報，2004，44（4）：511-513. 賈橋東，張保全，王衛民，等. 煙草白粉病的研究進展[J]. 江蘇農業科學，2019，47（4）：94-97.