鴨源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

王紅琳 盧琴 張騰飛 張文婷 羅青平 汪宏才 張蓉蓉 羅玲 邵華斌

摘要：為了查明監利縣某鴨場產蛋鴨突然死亡的病因，對樣品進行細菌分離、生化鑒定、PCR擴增鑒定、致病性試驗及藥敏試驗。結果表明，分離菌與多殺性巴氏桿菌同源性達99.88%，分離菌的莢膜抗原血清型特異性基因PCR產物與莢膜血清A型基因同源性達99.90%，確定病原菌為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌;該菌株對大觀霉素高度敏感，對阿米卡星、新霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、克林霉素、阿奇霉素等中度敏感，對頭孢曲松、鏈霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑、氟苯尼考、四環素、呋喃妥因、潔霉素等具有耐藥性。

關鍵詞：多殺性巴氏桿菌;莢膜血清A型;PCR鑒定;藥敏試驗

中圖分類號：S834+.8? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）12-0116-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.027? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to elucidate the cause of sudden death of laying-duck in a duck farm in Jianli， which the pathogen was determined to be capsular serotype A Pasteurella multocida by bacterial isolation，biochemical identification，mouse pathogenicity test and PCR amplification. The results showed that the isolate had 99.88% homology with Pasteurella multocida， and the PCR product of the capsular antigen serotype-specific gene of the isolate was 99.90% homologous with the Capsular Serotype A， and the pathogen was determined to be Pasteurella multocida strains belonged to capsular serotype A. In order to investigate the drug resistance， the results of drug susceptibility test showed the pathogen was highly sensitive to spectinomycin， moderately sensitive to amikacin， neomycin， norfloxacin， ofloxacin， clindamycin， azithromycin， while resistance to ceftriaxone， streptomycin， co-trimoxazole， sulfisoxazole， fluoride benignic， tetracycline， nitrofurantoin， lincomycin， which provided guidance for clinical rational medication.

Key words： Pasteurella mutocida; capsular serotype A; PCR identification; drug-sensitivity test

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella mutocida）可引起鴨巴氏桿菌病（又稱鴨霍亂），該病是一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，產蛋鴨的發病率較高。常呈現急性敗血癥過程，急性型發病率和死亡率可高達80%～90%，也見慢性或良性經過。呈世界性分布，是嚴重危害養禽業的重要細菌性傳染病之一;在同種禽間傳染快，在異種禽間可傳染，豬及人類也可攜帶病菌。帶菌的表面健康禽只，在飼養管理不當（如斷料、斷水或突然改變飼料），季節交替、氣候突變等應激條件下，動物機體抵抗力下降時，易發生內源性傳染而發病，呈地方性流行[1]。由于多殺性巴氏桿菌根據莢膜抗原可以分為5種血清型，即A、B、D、E和F型，且不同血清型之間交叉免疫保護力較差，目前國內家禽中主要流行的是A型[2]，因此對病原鑒定時有必要鑒定其血清型，為分子流行病學調查和疫苗候選株的選擇提供試驗依據。

隨著集約化、放牧式養鴨的迅速發展，鴨巴氏桿菌病發病率呈上升趨勢，造成的危害越來越嚴重。雖然抗生素對于鴨霍亂的防治具有一定的療效，但普遍存在著停藥后容易復發的缺點，同時長期用藥及濫用導致細菌的耐藥性日趨嚴重，因此，對地方分離菌株進行藥敏試驗，對臨床合理用藥具有重要的指導作用。本研究通過細菌分離培養、生化鑒定、小鼠致病性試驗、PCR種屬及分型鑒定，確定病原菌為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌，藥敏試驗結果為該分離菌株對大觀霉素、諾氟沙星等藥物敏感，可為臨床合理用藥提供參考依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 病料來源? 2018年1月湖北省監利縣某鴨場260日齡的產蛋鴨，發病呈急性經過，用氟苯尼考等抗生素治療，無明顯效果。剖檢發現，心包膜增厚、出血，肝臟腫大、表面有灰白色小點，脾臟腫大出血，各段腸黏膜出血。無菌采集心臟、肝臟等組織，保存備用。

1.1.2? 培養基及試劑培養基? 胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、麥康凱瓊脂培養基（MAC）、水解酪蛋白培養基（MH）、小牛血清等，均購自武漢潔洋盛科技有限公司;小量液體樣品核酸抽提試劑盒，購自上海華舜生物技術有限公司;藥敏試驗質控標準菌株，大腸桿菌CMCC 44102，購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心;抗菌藥物紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3? 試驗小鼠? 昆明小鼠，體重為18～20 g，購自湖北省疾病預防控制中心。

1.2? 方法

1.2.1? 細菌的分離純化? 取無菌采集的病變組織同時涂抹在含5%小牛血清TSA和MAC平板上，并劃線，置于37 ℃恒溫箱內培養18～24 h。觀察菌落形態，挑取典型菌落革蘭氏染色、鏡檢，同時劃線接種含5%小牛血清TSA平板純化培養。

1.2.2? 生化鑒定? 對分離的病原菌株按常規方法進行生化試驗[3]。將所獲得分離菌的純培養菌落1～2個，分別接種于各微量生化發酵管內，置37 ℃培養24～48 h，定時檢查反應結果。

1.2.3? PCR擴增鑒定

1）PCR引物合成。挑取TSA平板上純化菌落，提取細菌基因組作DNA模板，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成細菌16S rRNA通用引物，上游引物P1：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′，下游引物P2：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′;參照Townsend等[4]合成多殺性巴氏桿菌A、B、D、E、F莢膜血清型特異性基因引物capA、capB、capD、capE、capF。

2）PCR擴增。種屬特異性PCR 20 μL反應體系：2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）10 μL，無菌水8 μL，上、下游引物各1 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環;72 ℃延伸7 min。分型使用mPCR 方法，反應條件與種屬特異性 PCR 反應條件一致。

1.2.4? 致病性試驗? 挑取純化的單個菌落接種于含5%小牛血清的TSB，37 ℃搖床培養12～18 h;采用表面培養測定法進行活菌計數，然后稀釋為2×108 CFU/mL。試驗分為2組：試驗組5只小鼠，每只腹腔注射菌液0.2 mL;對照組2只，每只腹腔注射無菌TSB 0.2 mL。觀察、記錄小鼠發病與死亡情況。死亡小鼠立即剖檢，觀察病變并進行病原菌的分離鑒定。

1.2.5? 藥敏試驗? 采用紙片擴散（K-B）法進行[5]。將分離菌的純培養物均勻涂布于MH培養基平板上，貼上15種藥敏紙片：大觀霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢曲松、阿米卡星、阿奇霉素、克林霉素、新霉素、鏈霉素、氟苯尼考、呋喃妥因、磺胺異惡唑、復方新諾明、四環素、潔霉素，37 ℃培養24 h后觀察，量取抑菌圈的直徑，結果的判定按照抗微生物藥物敏感性試驗執行標準（CLSI）2010版。

2? 結果與分析

2.1? 細菌分離純化

細菌在TSA平板上可見有單個灰白色、圓形、濕潤、針尖大小的菌落，革蘭氏染色鏡檢為陰性球桿菌，且成對排列;而在MAC平板上無菌生長。

2.2? 生化鑒定

葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、硫化氫、硝酸鹽還原為陽性，木糖、山梨醇、麥芽糖、棉子糖、鼠李糖、乳糖、衛矛醇、尿素酶、乙酰甲基甲醇試驗（V-P）為陰性，符合多殺性巴氏桿菌特有的生化特征。

2.3? PCR擴增鑒定

在460 bp處得到預期的目的條帶（圖1），將PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在GenBank中進行同源性比對，與多殺性巴氏桿菌同源性達99.88%。PCR檢測A、B、D、E、F莢膜血清型特異性基因，結果僅capA引物擴增出了目的片段（1 044 bp），經測序比對與莢膜血清A型的特異性基因（hyaD-hyaC）同源性達99.90%，其他引物對均未獲得擴增片段。

根據分菌菌株的培養特性、形態特征和16 S rRNA序列比對及PCR分型鑒定結果，確定該分離菌株為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌。

2.4? 致病性試驗

試驗組的5只小鼠接種后8 h，均出現精神萎靡、食欲減退、腹瀉等癥狀，隨后在24～48 h內全部陸續死亡;而對照組2只小鼠無發病和死亡，全部健康。無菌采取死亡小鼠心血制成涂片后革蘭氏染色鏡檢，同時進行細菌分離培養。鏡檢可見大量革蘭氏陰性球桿菌，在大小、形態特征、排列方式、染色特性上均與初次分離菌株以及接種菌株基本相同。

2.5? 藥敏試驗

從表1中可看出，該菌株對大觀霉素高度敏感，對諾氟沙星、氧氟沙星、阿米卡星、新霉素、克林霉素、阿奇霉素等中度敏感，對頭孢曲松、鏈霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑、氟苯尼考、四環素、呋喃妥因、潔霉素等耐藥。

3? 討論

鴨霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起的一種接觸性傳染病，特點是發病快、發病率和死亡率高，主要通過呼吸道和消化道傳染;飼養管理不當和環境惡劣是該病的主要誘因。本研究對一例急性死亡病鴨進行細菌分離，將常規的生化試驗與分子生物學鑒定手段相結合，能夠快速準確地判斷病因，為臨床診斷和治療提供可靠依據。通過莢膜血清型的PCR鑒定，確定其為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌，與文獻報道的鴨霍亂病例的血清型一致[6，7]，說明莢膜血清A型仍然是國內家禽中多殺性巴氏桿菌主要流行的血清型。近年來，鴨霍亂的發病率逐漸上升，且性成熟的鴨最易感，而母源性抗體不能起到有效保護作用，利用地方分離菌株制備自價滅活苗有較好的預防效果[8，9]。

為了解發病地區多殺性巴氏桿菌的耐藥情況，對分離菌株進行了藥敏試驗。從藥敏試驗結果分析發現，耐藥情況非常嚴重，15種抗生素藥物中，高度敏感的只有1種藥物，高敏率為6.67%（1/15），耐藥率達到53.33%（8/15），這與養殖場用藥不規范及濫用有關。由于不同地區存在著流行菌株與抗生素使用情況的差異，導致多殺性巴氏桿菌的地區分離菌株耐藥性也存在著差異[10，11]，極大地增加了治療時藥物選擇的難度，應引起足夠重視。

防控鴨霍亂的最有效措施是采取防治結合、防重于治的原則，做好養殖環境的隔離、衛生消毒工作，加強飼養管理，避免潮濕、擁擠、營養缺乏等不良應激因素的影響，增強鴨個體機體抵抗力，積極采取疫苗免疫預防，從而減少或杜絕疾病的發生。早發現、早診斷、及時用藥和準確用藥也是關鍵，如果發病初期及時采取藥物、疫苗給予控制，并將病鴨隔離，無害化處理死亡鴨，用生石灰水等消毒劑進行場地和器械徹底消毒，則疫情可以得到迅速控制。

參考文獻：

[1] SAIF Y M.禽病學[M].第12版.蘇敬良，高? 福，索? 勛，譯.北京：中國農業出版社，2012.871-886.

[2] 張? 媛，魏財文，李? 建，等.多重PCR在多殺性巴氏桿菌莢膜定群中的應用[J].中國獸醫科學，2014，44（12）：1286-1291.

[3] 韓文瑜，何昭陽，劉玉斌.病原細菌檢驗技術[M].吉林吉林：科學技術出版社，1992.

[4] TOWNSEND K M，BOYCE J D，CHUNG J Y，et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].J Clin Microbiol，2001，39（3）：924-929.

[5] 彭欠欠，蘇佳文，孫王楊吉，等.一株多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與耐藥性研究[J].中國家禽，2017，39（10）：51-53.

[6] 劉小龍，盧榮輝，程龍飛，等.麻鴨源多殺性巴氏桿菌的生物學特性分析[J].中國家禽，2016，38（22）：56-58.

[7] 程龍飛，許利娜，林建生，等.福建及鄰近省份禽源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J].中國動物傳染病學報，2014，22（4）：40-44.

[8] 趙戰勤，喬鵬蕓，劉倩玉，等.多殺性巴氏桿菌的分型及其滅活疫苗研究進展[J].中國預防獸醫學報，2017，39（7）：600-604.

[9] 常? 峰，魏? 巍，翁春玲，等.禽霍亂蜂膠滅活疫苗的免疫效力試驗[J].黑龍江畜牧獸醫，2005（7）：72.

[10] 張文波，冷? 闖，鄧舜洲，等.鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].中國家禽，2012，34（1）：63-64.

[11] 拜錦美，高明燕，錢海兵，等.一株鴨源多殺性巴氏桿菌的分離及鑒定[J].中國家禽，2008，30（24）：51-53.

收稿日期：2019-01-03

作者簡介：王紅琳（1966-），女，江蘇海安人，高級獸醫師，主要從事畜禽傳染病預防及生物制品研發工作，