不同抽薹性蘿卜遺傳多樣性的SSR分子標記分析

楊峰　冉茂林　李曉梅　陳琳　雍小平　冉科

摘要：為了加強對耐抽薹蘿卜種質資源的研究，加快耐抽薹蘿卜育種進程，從206對SSR分子標記引物中篩選出21對，用于57份不同抽薹性蘿卜材料進行遺傳多樣性分析。結果表明，PCR共擴增出102條條帶，平均4.86條，每對引物2～9條帶，其中具有多態性的為95條，多態性條帶百分率為93.14%。POPGENE分析結果表明，平均觀測等位基因數為2.967 4，平均有效等位基因數為2.419 1，有效等位基因比例為81.52%;平均Nei基因多樣性指數為 0.355 5，平均Shannon多態性指數為0.528 9。UPGMA法聚類結果把供試蘿卜材料分為3個類群，5個亞類：第Ⅰ類為來源于德國的極耐抽薹材料，第Ⅱ類為來源于韓國和日本的耐抽薹材料，第Ⅲ類為來源于我國的材料，其中第3亞類共有45份，占材料總數的78.95%，第4亞類為5份極易抽薹材料，第5亞類僅有1份。各材料間平均遺傳相似系數為0.638 1，變幅范圍0.347 8～0.934 8，>0.7的僅22.87%，遺傳差異較大。不同抽薹性蘿卜材料所表現出的豐富多樣性，對蘿卜種質資源管理和耐抽薹品種選育具有重要意義。

關鍵詞：蘿卜;抽薹;SSR標記;遺傳多樣性

中圖分類號： S631.103? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0123-05

蘿卜（Raphanus sativus L.）在世界各地均有種植，其中歐美國家主要栽培小型四季蘿卜，亞洲國家則主要栽培大型蘿卜[1]。蘿卜是我國重要的十字花科蔬菜作物，年種植面積在120萬hm2左右，位居全國各類蔬菜種植面積第3位，在蔬菜生產和供應上起到了重要作用[2]。在生產上，蘿卜比較容易發生“未熟抽薹”或“先期抽薹”現象，即蘿卜肉質根在未完全膨大時就抽薹，從而降低或失去商品價值，造成經濟損失。我國擁有眾多蘿卜種質資源，但開始耐抽薹品種選育的研究較晚，導致日本和韓國的耐抽薹品種大量進入國內，占據主要市場。因此，加強對耐抽薹蘿卜種質資源的研究，不斷培育新的種質資源，是加快耐抽薹蘿卜育種進程的重要途徑。

簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR）通常又稱為微衛星或者STMS（sequence-tagged microsatellites），是基于PCR的分子標記，普遍分布于真核生物基因組中，具有信息含量高、穩定性好、多態性高、操作和分析簡單等優點，現被廣泛用于蔬菜種質資源遺傳多樣性分析[3]及種質資源鑒定[4]等研究。近幾年以蘿卜為材料利用SSR標記進行的研究，主要包括圖譜構建[5-7]、基因組學[8]、轉錄組學[9]、表觀遺傳學[10]、純度鑒定[11-12]、育性鑒定[13]和肉質根色[14]等方面。本研究對57份不同抽薹性蘿卜材料進行SSR分析，旨在從分子水平上研究各材料遺傳背景和親緣關系，為選育耐抽薹蘿卜品種提供理論依據，以期實現分子標記輔助育種。

1 材料與方法

1.1 材料

供試57份不同抽薹性蘿卜材料，均由四川省農業科學院水稻高粱研究所蘿卜課題組提供。材料來源及其抽薹特性詳見表1。分子標記所需的SSR引物由四川成都擎科梓熙生物技術有限公司合成，Taq酶和dNTP購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 2018年2月26日，在蔬菜種質與品種創新四川省重點實驗室進行蘿卜穴盤育苗，待幼苗長至3張真葉時采嫩葉，用天根生化科技（北京）有限公司生產的高效植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，微量分光光度計（NanoDrop 2000）檢測DNA濃度和質量，將DNA濃度調至10 ng/μL，-20 ℃冰箱（海爾醫用低溫保存箱）保存備用。

1.2.2 PCR擴增及檢測 用Veriti Thermal Cycler PCR儀（Applied Biosystems公司）進行擴增。SSR-PCR反應采用 15 μL 體系，包括1.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+）、1.0 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.2 μL 5 U/μL Taq酶、50 ng/μL上、下游引物各0.5 μL、2.0 μL DNA模板，加ddH2O至15 μL。擴增程序：94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性40 s，55～62 ℃（不同SSR引物設不同退火溫度）退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物經10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測。

1.2.3 數據統計分析 將銀染結果進行統計，清晰且可重復條帶記為“1”，不重復且在同一位置上的弱帶或無條帶記為“0”，建立數據庫。統計PCR擴增產物的條帶總數和多態性條帶數，計算多態性條帶百分率P=i/j×100%，其中i為多態性條帶數，j為擴增總條帶數。用POPGENE 1.32統計觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei基因多樣性指數（H）及Shannon多樣性信息指數（I）[15]。利用NTSYS pc-2.10e分析數據，按非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析[16]。

2 結果與分析

2.1 SSR引物多樣性分析

搜索蘿卜基因組數據庫（http：//marker.kazusa.or.jp/Daikon/及http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/ radish/）中公布的與抽薹開花相關的SSR引物序列信息，合成了206對，并從中篩選出21對擴增條帶清晰、多態性明顯較好的引物。分別對57份材料進行PCR擴增，21對SSR引物的擴增結果如表2所示，共擴增出102條條帶，每對引物擴增出2～9條條帶，平均4.86條，其中具有多態性的95條，多態性條帶百分率為93.14%。表明本研究中篩選到的SSR引物多態性良好，有較顯著的檢出效率，可用于后續的遺傳多樣性分析。

2.2 遺傳多樣性分析

通過POPGENE 1.32軟件分析，得到表3結果，57份供試材料的平均觀測等位基因數為2.967 4，平均有效等位基因數為2.419 1，有效等位基因比例為81.52%。統計分析表明，平均Nei基因多樣性指數為0.355 5，平均Shannon多態性指數為0.528 9，均反映出供試材料較高的遺傳多樣性。

2.3 聚類分析

應用Masatoshi等的統計分析方法[17]，計算遺傳相似系數（GS），共獲得1 596個兩兩不同材料間的遺傳相似系數（表4），變幅為0.347 8～0.934 8，平均遺傳相似系數為 0.638 1，>0.7的僅占22.87%，其中18和19號材料間遺傳相似系數最大，為0.934 8，說明二者間親緣關系最近;2和18、31號間的遺傳相似系數最小，為0.347 8，說明它們之間的親緣關系最遠。由此可知，57份材料的遺傳背景豐富，可作為育種資源。

根據遺傳相似系數采用UPGMA法進行聚類分析，結果如圖1所示。以0.57為閾值可以把57份材料分為三大類群：第Ⅰ類包括1、2、3號材料，共3份，均為來源于德國的極耐抽薹材料，占所有極耐抽薹材料的50%;第Ⅱ類為4、5、6號材料，共3份，來源于韓國和日本;第Ⅲ類為其他51份材料，均來源于我國。進一步分析可以把第Ⅲ類分為3個亞類（第3、4、5亞類）：第3亞類共有45份，占所有供試材料的78.95%;第4亞類共有5份，均為極易抽薹材料，占所有極易抽薹材料的83.33%;第5亞類僅有42號材料。

3 討論與結論

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息的總和，對分析重要性狀和輔助育種具有重要意義。本研究中，SSR引物及遺傳多樣性結果說明，供試材料間遺傳相似程度較低，不同抽薹性蘿卜間遺傳差異較大，遺傳關系較遠，這與Wang等利用EST-SSR標記進行遺傳多樣性分析所得結果中引物多態性89.3%、平均多態信息含量（PIC）值0.39[18]相似。同時聚類分析結果中，本研究分類出的第Ⅲ大類與其研究分類得到的第Ⅰ大類較為相似，但其余分類結果差異較大。方平等對肉質色不同蘿卜遺傳多樣性的分析結果中，平均Na、Ne、I、GS值分別為8.7、5.162 7、1.76、0.85[19]，本研究結果與其差異較大。不同結果的產生，可能與材料來源的豐富程度尤其是野生型材料的多少有關。由于研究目的性狀的不同，所選用的分子標記差異較大，對遺傳多樣性結果的影響較大。

抽薹性狀為數量性狀，受外界環境影響大，在十字花科蔬菜中的相關研究較多。陳文輝等利用2種分子標記分析耐抽薹大白菜的遺傳多樣性，其中SRAP標記的平均多態性條帶和比率均比ISSR標記高，平均GS值較小而GS變幅較大，來源日本、韓國和我國山東的品種各聚為一類，反映出耐抽薹大白菜間存在一定的地域差異[20]。高穎等利用57個SSR和InDel標記對大白菜抽薹開花時間進行關聯分析，將80份自交系及110份F1材料分為3個亞群體，發現13個標記的17個位點與抽薹時間和開花時間相關[21]。在耐抽薹蘿卜研究上，柳李旺等將甲基化敏感擴增多態性技術（MSAP）應用于蘿卜抽薹機理研究中，證明了DNA甲基化水平的變化影響蘿卜抽薹開花，揭示了甲基化水平降低有利于抽薹開花相關基因的表達[22]。劉哲等對蘿卜抽薹相關SRAP分子標記進行篩選與分析，獲得116對多態性引物組合，多態性40.3%，多態性條帶范圍為0～5，得到1個與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標記，遺傳距離為5.7 cM[23]。本研究中，來源于德國的極耐抽薹蘿卜材料分在第Ⅰ大類，日本的極耐抽薹材料時大根在第Ⅱ大類，第Ⅲ大類中則包括了極耐抽薹的藏蘿1號和自育的C60223，三類間的親緣關系較遠。其中，日本的時大根與黑蘿卜、藏蘿1號和C60223間的GS值分別為0.46、0.50、0.43，遺傳差異大，可作為耐抽薹雜交親本材料加以利用。同時，本研究的聚類結果可將大部分地理來源相近的材料聚為一類，但與抽薹性狀之間仍存在差別。例如，第4亞類將來源于我國的極易抽薹蘿卜材料聚為了一類，但第3亞類中卻不能較好地區別開抽薹性不同的材料。這可能是由于SSR標記體現的是種質材料間分子水平上的差異，而表型性狀差異是環境與基因互作的結果。

不同抽薹性蘿卜材料所表現出的豐富多樣性，對蘿卜種質資源管理和耐抽薹品種選育具有重要意義。本研究結果能在一定程度上反映出不同抽薹性蘿卜材料間的親緣關系，后續選擇遺傳相似度低、親緣關系遠的材料作為親本應用于育種，以提高后代遺傳重組率，增強雜種優勢。同時，應注意多種分子標記的結合，以期獲得更可靠的聚類結果。

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