不同抽薹性蘿卜遺傳多樣性的SSR分子標記分析

楊峰　冉茂林　李曉梅　陳琳　雍小平　冉科

摘要：為了加強對耐抽薹蘿卜種質(zhì)資源的研究，加快耐抽薹蘿卜育種進程，從206對SSR分子標記引物中篩選出21對，用于57份不同抽薹性蘿卜材料進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，PCR共擴增出102條條帶，平均4.86條，每對引物2～9條帶，其中具有多態(tài)性的為95條，多態(tài)性條帶百分率為93.14%。POPGENE分析結(jié)果表明，平均觀測等位基因數(shù)為2.967 4，平均有效等位基因數(shù)為2.419 1，有效等位基因比例為81.52%;平均Nei基因多樣性指數(shù)為 0.355 5，平均Shannon多態(tài)性指數(shù)為0.528 9。UPGMA法聚類結(jié)果把供試蘿卜材料分為3個類群，5個亞類：第Ⅰ類為來源于德國的極耐抽薹材料，第Ⅱ類為來源于韓國和日本的耐抽薹材料，第Ⅲ類為來源于我國的材料，其中第3亞類共有45份，占材料總數(shù)的78.95%，第4亞類為5份極易抽薹材料，第5亞類僅有1份。各材料間平均遺傳相似系數(shù)為0.638 1，變幅范圍0.347 8～0.934 8，>0.7的僅22.87%，遺傳差異較大。不同抽薹性蘿卜材料所表現(xiàn)出的豐富多樣性，對蘿卜種質(zhì)資源管理和耐抽薹品種選育具有重要意義。

關(guān)鍵詞：蘿卜;抽薹;SSR標記;遺傳多樣性

中圖分類號： S631.103? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0123-05

蘿卜（Raphanus sativus L.）在世界各地均有種植，其中歐美國家主要栽培小型四季蘿卜，亞洲國家則主要栽培大型蘿卜[1]。蘿卜是我國重要的十字花科蔬菜作物，年種植面積在120萬hm2左右，位居全國各類蔬菜種植面積第3位，在蔬菜生產(chǎn)和供應(yīng)上起到了重要作用[2]。在生產(chǎn)上，蘿卜比較容易發(fā)生“未熟抽薹”或“先期抽薹”現(xiàn)象，即蘿卜肉質(zhì)根在未完全膨大時就抽薹，從而降低或失去商品價值，造成經(jīng)濟損失。我國擁有眾多蘿卜種質(zhì)資源，但開始耐抽薹品種選育的研究較晚，導(dǎo)致日本和韓國的耐抽薹品種大量進入國內(nèi)，占據(jù)主要市場。因此，加強對耐抽薹蘿卜種質(zhì)資源的研究，不斷培育新的種質(zhì)資源，是加快耐抽薹蘿卜育種進程的重要途徑。

簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR）通常又稱為微衛(wèi)星或者STMS（sequence-tagged microsatellites），是基于PCR的分子標記，普遍分布于真核生物基因組中，具有信息含量高、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、操作和分析簡單等優(yōu)點，現(xiàn)被廣泛用于蔬菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[3]及種質(zhì)資源鑒定[4]等研究。近幾年以蘿卜為材料利用SSR標記進行的研究，主要包括圖譜構(gòu)建[5-7]、基因組學(xué)[8]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)[9]、表觀遺傳學(xué)[10]、純度鑒定[11-12]、育性鑒定[13]和肉質(zhì)根色[14]等方面。本研究對57份不同抽薹性蘿卜材料進行SSR分析，旨在從分子水平上研究各材料遺傳背景和親緣關(guān)系，為選育耐抽薹蘿卜品種提供理論依據(jù)，以期實現(xiàn)分子標記輔助育種。

1 材料與方法

1.1 材料

供試57份不同抽薹性蘿卜材料，均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所蘿卜課題組提供。材料來源及其抽薹特性詳見表1。分子標記所需的SSR引物由四川成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，Taq酶和dNTP購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 2018年2月26日，在蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室進行蘿卜穴盤育苗，待幼苗長至3張真葉時采嫩葉，用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的高效植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，微量分光光度計（NanoDrop 2000）檢測DNA濃度和質(zhì)量，將DNA濃度調(diào)至10 ng/μL，-20 ℃冰箱（海爾醫(yī)用低溫保存箱）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增及檢測 用Veriti Thermal Cycler PCR儀（Applied Biosystems公司）進行擴增。SSR-PCR反應(yīng)采用 15 μL 體系，包括1.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+）、1.0 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.2 μL 5 U/μL Taq酶、50 ng/μL上、下游引物各0.5 μL、2.0 μL DNA模板，加ddH2O至15 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性40 s，55～62 ℃（不同SSR引物設(shè)不同退火溫度）退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 將銀染結(jié)果進行統(tǒng)計，清晰且可重復(fù)條帶記為“1”，不重復(fù)且在同一位置上的弱帶或無條帶記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫。統(tǒng)計PCR擴增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，計算多態(tài)性條帶百分率P=i/j×100%，其中i為多態(tài)性條帶數(shù)，j為擴增總條帶數(shù)。用POPGENE 1.32統(tǒng)計觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）及Shannon多樣性信息指數(shù)（I）[15]。利用NTSYS pc-2.10e分析數(shù)據(jù)，按非加權(quán)組平均法（UPGMA）進行聚類分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多樣性分析

搜索蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//marker.kazusa.or.jp/Daikon/及http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/ radish/）中公布的與抽薹開花相關(guān)的SSR引物序列信息，合成了206對，并從中篩選出21對擴增條帶清晰、多態(tài)性明顯較好的引物。分別對57份材料進行PCR擴增，21對SSR引物的擴增結(jié)果如表2所示，共擴增出102條條帶，每對引物擴增出2～9條條帶，平均4.86條，其中具有多態(tài)性的95條，多態(tài)性條帶百分率為93.14%。表明本研究中篩選到的SSR引物多態(tài)性良好，有較顯著的檢出效率，可用于后續(xù)的遺傳多樣性分析。

2.2 遺傳多樣性分析

通過POPGENE 1.32軟件分析，得到表3結(jié)果，57份供試材料的平均觀測等位基因數(shù)為2.967 4，平均有效等位基因數(shù)為2.419 1，有效等位基因比例為81.52%。統(tǒng)計分析表明，平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.355 5，平均Shannon多態(tài)性指數(shù)為0.528 9，均反映出供試材料較高的遺傳多樣性。

2.3 聚類分析

應(yīng)用Masatoshi等的統(tǒng)計分析方法[17]，計算遺傳相似系數(shù)（GS），共獲得1 596個兩兩不同材料間的遺傳相似系數(shù)（表4），變幅為0.347 8～0.934 8，平均遺傳相似系數(shù)為 0.638 1，>0.7的僅占22.87%，其中18和19號材料間遺傳相似系數(shù)最大，為0.934 8，說明二者間親緣關(guān)系最近;2和18、31號間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.347 8，說明它們之間的親緣關(guān)系最遠。由此可知，57份材料的遺傳背景豐富，可作為育種資源。

根據(jù)遺傳相似系數(shù)采用UPGMA法進行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。以0.57為閾值可以把57份材料分為三大類群：第Ⅰ類包括1、2、3號材料，共3份，均為來源于德國的極耐抽薹材料，占所有極耐抽薹材料的50%;第Ⅱ類為4、5、6號材料，共3份，來源于韓國和日本;第Ⅲ類為其他51份材料，均來源于我國。進一步分析可以把第Ⅲ類分為3個亞類（第3、4、5亞類）：第3亞類共有45份，占所有供試材料的78.95%;第4亞類共有5份，均為極易抽薹材料，占所有極易抽薹材料的83.33%;第5亞類僅有42號材料。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息的總和，對分析重要性狀和輔助育種具有重要意義。本研究中，SSR引物及遺傳多樣性結(jié)果說明，供試材料間遺傳相似程度較低，不同抽薹性蘿卜間遺傳差異較大，遺傳關(guān)系較遠，這與Wang等利用EST-SSR標記進行遺傳多樣性分析所得結(jié)果中引物多態(tài)性89.3%、平均多態(tài)信息含量（PIC）值0.39[18]相似。同時聚類分析結(jié)果中，本研究分類出的第Ⅲ大類與其研究分類得到的第Ⅰ大類較為相似，但其余分類結(jié)果差異較大。方平等對肉質(zhì)色不同蘿卜遺傳多樣性的分析結(jié)果中，平均Na、Ne、I、GS值分別為8.7、5.162 7、1.76、0.85[19]，本研究結(jié)果與其差異較大。不同結(jié)果的產(chǎn)生，可能與材料來源的豐富程度尤其是野生型材料的多少有關(guān)。由于研究目的性狀的不同，所選用的分子標記差異較大，對遺傳多樣性結(jié)果的影響較大。

抽薹性狀為數(shù)量性狀，受外界環(huán)境影響大，在十字花科蔬菜中的相關(guān)研究較多。陳文輝等利用2種分子標記分析耐抽薹大白菜的遺傳多樣性，其中SRAP標記的平均多態(tài)性條帶和比率均比ISSR標記高，平均GS值較小而GS變幅較大，來源日本、韓國和我國山東的品種各聚為一類，反映出耐抽薹大白菜間存在一定的地域差異[20]。高穎等利用57個SSR和InDel標記對大白菜抽薹開花時間進行關(guān)聯(lián)分析，將80份自交系及110份F1材料分為3個亞群體，發(fā)現(xiàn)13個標記的17個位點與抽薹時間和開花時間相關(guān)[21]。在耐抽薹蘿卜研究上，柳李旺等將甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)（MSAP）應(yīng)用于蘿卜抽薹機理研究中，證明了DNA甲基化水平的變化影響蘿卜抽薹開花，揭示了甲基化水平降低有利于抽薹開花相關(guān)基因的表達[22]。劉哲等對蘿卜抽薹相關(guān)SRAP分子標記進行篩選與分析，獲得116對多態(tài)性引物組合，多態(tài)性40.3%，多態(tài)性條帶范圍為0～5，得到1個與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標記，遺傳距離為5.7 cM[23]。本研究中，來源于德國的極耐抽薹蘿卜材料分在第Ⅰ大類，日本的極耐抽薹材料時大根在第Ⅱ大類，第Ⅲ大類中則包括了極耐抽薹的藏蘿1號和自育的C60223，三類間的親緣關(guān)系較遠。其中，日本的時大根與黑蘿卜、藏蘿1號和C60223間的GS值分別為0.46、0.50、0.43，遺傳差異大，可作為耐抽薹雜交親本材料加以利用。同時，本研究的聚類結(jié)果可將大部分地理來源相近的材料聚為一類，但與抽薹性狀之間仍存在差別。例如，第4亞類將來源于我國的極易抽薹蘿卜材料聚為了一類，但第3亞類中卻不能較好地區(qū)別開抽薹性不同的材料。這可能是由于SSR標記體現(xiàn)的是種質(zhì)材料間分子水平上的差異，而表型性狀差異是環(huán)境與基因互作的結(jié)果。

不同抽薹性蘿卜材料所表現(xiàn)出的豐富多樣性，對蘿卜種質(zhì)資源管理和耐抽薹品種選育具有重要意義。本研究結(jié)果能在一定程度上反映出不同抽薹性蘿卜材料間的親緣關(guān)系，后續(xù)選擇遺傳相似度低、親緣關(guān)系遠的材料作為親本應(yīng)用于育種，以提高后代遺傳重組率，增強雜種優(yōu)勢。同時，應(yīng)注意多種分子標記的結(jié)合，以期獲得更可靠的聚類結(jié)果。

參考文獻：

[1]方智遠. 中國蔬菜育種學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2017：703.

[2]汪隆植，何啟偉. 中國蘿卜[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社，2005：1314.

[3]唐榮華，張君誠，吳為人. SSR分子標記的開發(fā)技術(shù)研究進展[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，15（4）：106-109.

[4]王曉武，杜永臣. 蔬菜作物分子育種研究現(xiàn)狀與趨勢[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2007，9（2）：14-18.

[5]邱 楊，李錫香，李清霞，等. 利用SSR標記構(gòu)建蘿卜種質(zhì)資源分子身份證[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2014，15（3）：648-654.

[6]王慶彪，張 麗，鄭鵬婧，等. 秋紅蘿卜SSR指紋圖譜構(gòu)建及其應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2015，13（8）：1794-1801.

[7]Masato T，Keita S，Nakao K，et al.Construction of a molecular linkage map of radish （Raphanus sativus L.），based on AFLP and Brassica-SSR markers[J]. Breeding Science，2005，55（1）：107-111.

[8]Ryoichi N，Tomoko H，Naoko M，et al.Development of genomic and EST-SSR markers in radish （Raphanus sativus L.）[J]. Breeding Science，2011，61（4）：413-419.

[9]Zhai L L，Xu L，Wang Y，et al.Novel and useful genic-SSR markers from de novo transcriptome sequencing of radish （Raphanus sativus L.）[J]. Molecular Breeding，2014，33（3）：611-624.

[10]Zhai L L，Liu L W，Zhu X W，et al.Development，characterization and application of novel expressed sequence tag- simple sequence repeat （EST-SSR） markers in radish （Raphanus sativus L.）[J]. African Journal of Biotechnology，2013，12（9）：921-935.

[11]李竟才，李世升，張娜娜，等. 白蘿卜純度鑒定的SSR分子標記篩選與鑒定[J]. 分子植物育種，2018，16（8）：2525-2532.

[12]張小康，朱運峰，陳玉霞，等. SSR分子標記技術(shù)在漢青一號蘿卜種子純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（19）：5069-5071.

[13]韓曉雨. 蘿卜雄性不育系及其保持系的生理生化分析和SSR標記研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[14]付衛(wèi)民，王淑芬，何啟偉，等. 心里美蘿卜肉質(zhì)根內(nèi)花青素相關(guān)基因的EST-SSR標記篩選[C]// 中國園藝學(xué)會十字花科蔬菜分會第十屆學(xué)術(shù)研討會論文集. 北京：中國園藝學(xué)會，2012：5.

[15]Francis C Y，Rong C Y，Boyle T.POPGENE version 1.32，Microsoft windows-based freeware for population genetic analysis[M]. Edmonton：University of Alberta，1999：45-68.

[16]Rohlf F.NTSYS-pc Version 2.1.Numerical taxonomy system and multivariate analysis system[M]. New York：Exeter Software，2002：57-66.

[17]Masatoshi N.Molecular evolutionary genetics[M]. New York：Columbia University Press，1989：150-154.

[18]Wang Q B，Zhang L，Zheng P J.Genetic diversity and evolutionary relationship analyses within and among Raphanus species using EST-SSR markers[J]. Molecular Breeding，2015，35：62.

[19]方 平，陳發(fā)波，姚啟倫，等. 肉質(zhì)色不同蘿卜遺傳多樣性的SSR分子標記分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2012，12（2）：226-232.

[20]陳文輝，方淑桂，曾小玲，等. 利用ISSR和SRAP標記分析耐抽薹大白菜的遺傳多樣性[J]. 熱帶作物學(xué)報，2011，32（10）：1858-1863.

[21]高 穎，羅雙霞，王彥華，等. 大白菜抽薹開花時間與SSR和InDel標記的關(guān)聯(lián)分析[J]. 園藝學(xué)報，2012，39（6）：1081-1089.

[22]柳李旺，宋賢勇，龔義勤，等. 蘿卜MSAP體系優(yōu)化與抽薹過程中MSAP分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（6）：203-206.

[23]劉 哲，許園園，蘇小俊. 蘿卜抽薹相關(guān)SRAP分子標記篩選與分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：74-76.孫翰昌，楊 帆，郭玉陽. 斑點叉尾血液學(xué)指標及血細胞特點分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（4）：128-131.