斑點叉尾血液學指標及血細胞特點分析

孫翰昌　楊帆　郭玉陽

摘要：擬測定斑點叉尾的血液生理生化指標及細胞形態。結果表明，細胞形態豐富，包含原紅細胞、早幼紅細胞、晚幼紅細胞、紅細胞、原粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、血栓細胞、淋巴細胞等，但未檢測到嗜堿性粒細胞;谷丙轉氨酶活性為（9.60±1.52） U/L，血糖濃度為（0.15±0.08） mmol/L，血清總蛋白濃度為（35.16±5.01） g/L，總膽固醇濃度為（5.37±0.77） mmol/L，白蛋白濃度為（10.92±2.27） g/L，堿性磷酸酶活性為（19.60±4.45） U/L，肌酐濃度為（37.54±2.05） μmol/L，尿素濃度為（1.26±0.20） mmol/L，總膽紅素濃度為（25.86±8.77） μmol/L。研究結果可作為斑點叉尾正常血液生化指標。

關鍵詞：斑點叉尾;血液指標;血細胞;代謝

中圖分類號： S917.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0128-03

魚類血液與機體的代謝、營養狀況及疾病有著密切關系，可以作為評價魚類生理狀況的有效指標，在評價魚類的營養狀況、健康水平、應激反應等方面發揮著重要的作用[1]。魚類的血液反映了魚類機體非特異性免疫和特異性免疫機能的變化，相關參數是診斷疾病和評價健康狀況的重要指標，建立具有臨床意義的常規血細胞參數對魚病防治具有重要意義[2]。斑點叉尾（Ietalurus punetaus）又稱鉗魚，原產于美洲，雜食性，具有適應能力強、生長迅速、抗性強、肉細味美、營養豐富、經濟價值高等特點[3]。人們對斑點叉尾的研究主要聚焦于生長性能、肌肉品質、疾病防治等方面，但關于血液生物化學方面的研究較少[4-5]。筆者通過研究斑點叉尾血液生化特性，可以確定其血液正常生化指標的參考范圍，建立魚類血液生化指標的數據庫，旨在為斑點叉尾的生物學研究和保護提供基礎的科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 2016年10月13日從重慶市永川玉屏市場購得斑點叉尾共50尾，每尾體質量為（500±25） g左右。實驗室馴養1周，試驗用水為充分曝氣的自來水，充氣泵每天24 h不間斷充氧。每天按試驗魚體質量的3%投喂商業配合飼料，試驗挑選活潑健康、表面無傷的20尾魚。

1.1.2 試劑、器材 魚血抗凝劑：1%肝素溶液10 mL（可抗凝血劑量為10 mL/mg，用時取5 mL血加50 μL 1%肝素）。瑞-吉染液（Wrights-Giemsas染液）：瑞氏粉1 g、吉氏粉 1 g、甘油 100 mL、甲醇400 mL，將全部染料放入乳缽內，先加少量甲醇慢慢研磨成糊狀，使染料全部溶解，再加100 mL甘油研磨均勻，倒入潔凈的棕色瓶內，所剩染料中再加少許甲醇進行研磨，如此反復直至將甲醇全部用完。將配好的染液在37 ℃溫箱中放置1周，每天上下午各搖蕩1次。

染液緩沖液（pH值6.4～6.8）：1%磷酸二氫鉀溶液 30 mL，1%磷酸氫二鈉溶液20 mL，加蒸餾水至1 000 mL。

紅細胞稀釋液：NaCl（維持滲透壓）0.5 g，Na2SO4（使溶液比重增加，紅細胞均勻分布不易下沉）2.5 g，HgCl2（固定紅細胞并防腐）0.25 g，加蒸餾水至100 mL。

白細胞稀釋液：冰醋酸（破壞紅細胞）1.5 mL，1.1%龍膽紫（染白細胞核，便于計數）1 mL，加蒸餾水至100 mL。

器材：Neubauer計數板（或血細胞計數板）;日本東芝TMS-1024H型全自動生化分析儀及配套試劑;E600生物顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 采血 5 mL離心管經1%肝素鈉濕潤后干燥備用，魚體用尾靜脈斷尾采血法采集血液5 mL。

1.2.2 生理指標檢測 取3 mL血液，于56 ℃水浴2 h，5 000 r/min 離心10 min，取上清于500 μL于日本東芝 TMS-1024H型全自動生化分析儀測定血液學指標。用丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒（IFCC法）檢測丙氨酸氨基轉移酶，用苦味酸法檢測肌酐，用血糖測定試劑盒（GOD-PAP法）測血糖，用AMP法檢測檢測堿性磷酸酶，用Doumas法測總蛋白，用BCG法測定白蛋白，用UV-GLDH法測尿素，用COD-CE-PAP法測定總膽固醇，氧化法檢測總膽紅素，試驗中所用到的試劑盒均購自四川省邁克科技有限責任公司。

1.2.3 光鏡樣品制備 取1滴血滴于干凈無油脂的玻片一端，推片形成均勻血膜，將玻片自然晾干。為防止血膜脫落，先用甲醇固定2～3 min，干燥后用瑞-吉染液染色，于油鏡下觀察并拍照。

1.2.4 血細胞計數 紅細胞（RBC）計數：紅細胞稀釋液 3.98 mL，加入抗凝血20 μL，使血液稀釋200倍，用血細胞計數板在顯微鏡下觀察計數，其計算公式為：紅細胞數（103個/mL）=5個中格紅細胞數×稀釋倍數/計數室的5個中方格的體積。

白細胞數（WBC）計數：白細胞稀釋液0.38 mL，加入抗凝血20 μL，使血液稀釋20倍，用血細胞計數板在顯微鏡下觀察計數四角的4個大方格內的白細胞，將其總數乘以50，即得紅細胞數（103個/mL）。

2 結果與分析

2.1 血液指標測定

斑點叉尾的血液指標測定結果如表1所示?？梢钥闯?，受試斑點叉尾的ALT值為9.60 U/L，GLU值為 0.15 mmol/L，TP值為35.16 g/L，CHOL值為5.37 mmol/L，ALB值為10.92 g/L，ALP值為19.6 U/L，Cre值為 37.54 μmol/L，BUN值為 1.26 mmol/L，Tbi值為25.86 μmol/L，除血清中總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBi）有較大的變化范圍外，其他值偏差均不大。

2.2 血細胞形態觀察

原紅細胞。細胞圓形或橢圓形，胞體較大，胞質較少，染成深藍色，不透明且著色均勻。胞核大，占細胞的大部分，居中或偏于細胞一側，核膜清晰，核仁可見，有凹陷感。核內染色質較濃，染成紫紅色，呈粗粒狀。胞核周圍有淺紅色的環核帶區存在（圖1-1）。

早幼紅細胞。細胞圓形或橢圓形，胞體胞核均較原紅細胞的小，但核質比仍較大，核內染色質呈紫紅色。胞質顏色淺藍色或灰藍色，核內染色質逐漸變粗，胞質出現血紅蛋白，核膜明顯，核內染色質更粗糙（圖1-2）。

晚幼紅細胞。細胞圓形或橢圓形，胞質染成橘黃色至橘紅色，核更致密。細胞體積較成熟紅細胞的體積稍大，胞核圓或橢圓形，胞質血紅蛋白豐富而呈現橘紅色，胞核周圍著色稍淺（圖1-3）。

紅細胞。胞體圓形或橢圓形，光滑無胞突，胞核中位或稍偏，胞核圓形或橢圓形，染色質致密呈團塊狀，染成深紫紅色，沿核周圍或中央分布，胞質豐富（圖1-4）。

原粒細胞。與原紅細胞相似，但原粒細胞胞質嗜堿性稍弱，染色質呈更細的粒狀。胞體圓形或卵圓形，胞質量少，染成藍色，著色均勻透明無顆粒。核質比例大，約為2/3～4/5。胞核圓形或橢圓形，居中或稍偏一側，核染色質呈紫紅色細沙粒狀均勻分布，核仁可見有外凸感（圖1-6、圖1-21）。

嗜酸性粒細胞。相對而言，這類細胞數量較少。細胞圓形或不規則圓形，細胞核有圓形、分葉形及不規則形。核染成暗紫紅色，周圍細胞質中有明顯的紅色大顆粒。（圖1-7、圖1-8）。

單核細胞。細胞圓形或橢圓形，胞質淺藍紫色，量多，可見空泡，表面常有細長或粗短的突起。胞核較大，形態多樣，約占整個細胞的1/3～1/2，偏于細胞的一側，無核仁，核內染色質疏松，染成淺紫紅色。胞質中可見細小顆粒及大小不等的空泡（圖1-9、圖1-10）。

巨噬細胞。細胞體積大，胞質中有很多空泡，核染色質著色淺，核邊界不清晰，靠近細胞邊緣，可見其內有吞噬的無核紅細胞（胞質小體）及其他吞噬物。內吞噬物較少，形態及染色與單核細胞相似（圖1-11、圖1-12）。

血栓細胞。在血涂片中往往數個（3～6）聚集在一起，細胞呈不規則橢圓形、棒狀、蝌蚪狀、馬蹄形、淚滴形、紡錘形，核所占比例很大，致密的染色質染成深紫紅色甚至暗紫紅色。細胞質邊界不明，淡藍色或淺紅色，在核外一側或周圍隱約可見;在棒狀細胞中，細胞質見于細胞的一端，呈淺紅色;或只在核的外緣有1層淺淡的紅色薄層。核有切跡或凹陷（圖1-13、圖1-14）。

淋巴細胞。淋巴細胞以不規則圓形居多。細胞核圓形，中位或稍偏位，多數核上有清晰可見的缺刻，核所占比例很大，可達4/5以上，染色較深，暗紫紅色。細胞質被染成較深的藍色或灰藍色，顆粒細膩，但不甚均勻。表面常有偽足狀突起（圖1-16～圖1-18）。

網狀細胞。細胞胞體很大，類圓形，不規則，有很多偽足樣突起。胞核大，橢圓形或類圓形，染色質細沙粒狀。胞質淺藍色，染色不均勻，在形態特征上類似于哺乳動物的造血基質細 胞- 網狀細胞（圖1-19）。

3 討論

3.1 采血過程

在試驗魚生理狀態穩定的情況下采血，確保血液生化指標的參數變化范圍合理。在魚類運輸過程中會產生血液紅細胞數量和白細胞分類百分比的顯著變化[6]，試驗魚運回實驗室后進行了1周的馴化飼養，以消除這類應激因子的影響。另外不合適的抗凝劑使用可能導致涂片血細胞嚴重變形[7]，本研究在前期預試驗中比較研究了不使用抗凝劑與使用肝素鈉抗凝劑或檸檬酸鈉抗凝對涂片血細胞形態的影響，結果表明，不使用抗凝劑與使用肝素鈉抗凝劑或檸檬酸鈉抗凝劑對涂片血細胞形態產生的影響不明顯。

3.2 血液指標

魚類血液生化指標受諸多因素（如年齡、性別、水溫、季節和營養狀況等）的影響[8-9]，反映了魚體健康狀況及營養水平，可作為水體環境變化、污染物的監測指標，也是疾病診斷的重要依據。本研究結果表明，斑點叉尾血清中總蛋白濃度、堿性磷酸酶活性、總膽紅素濃度有較大的變化范圍，而血清總蛋白濃度在其他鯉科[10]、鲇形目[11]、鱸形目[12]、鱘科魚類[13]的研究中也存在類似現象。在正常情況下，魚類體內有機成分的分解代謝與合成代謝保持動態平衡，其指標值也相對穩定。斑點叉尾膽固醇濃度為5.37 mmol/L，高于白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、 銀鯽（Carassius auratus gibelio）、

鯉魚（Cyprinus carpio）;血清總蛋白濃度為35.16 g/L，與鳙魚相近，低于白鰱、草魚、銀鯽和鯉魚;而白蛋白濃度為 10.92 g/L，與鳙魚和鯉魚相近，高于白鰱，低于草魚和銀鯽[14]，提示魚類血液生化指標還因品種差異而不同。總的來說，魚類血液指標值由高到低的順序是肉食性魚類>草食性或雜食性魚類>濾食性魚類。

3.3 血細胞的形態

哺乳動物紅細胞呈雙面凹陷的圓盤狀，沒有細胞核，細胞質內沒有細胞器而有大量血紅蛋白;而大多數魚類的紅細胞有細胞核，紅細胞中也含有血紅蛋白，因而使胞液呈紅色;血細胞的種類雖沒有哺乳動物的多，但仍具有基本的形態和功能。

魚類是低等的脊椎動物，其幼紅細胞可以在外周血中成熟，甚至在外周血中直接分裂[15]，直接分裂的紅細胞在未成熟的歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）外周血中有報道，但成熟歐洲鰻鱺外周血中沒有[16]。本研究的試驗魚為斑點叉尾成魚，其外周血中仍有幼紅細胞和直接分裂的紅細胞，試驗中觀察到斑點叉尾的紅細胞形態比較多樣，與龍華等的報道[17]相同。

魚類血液的白細胞種類很多，包括淋巴細胞、血栓細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、漿細胞和巨噬細胞等。有些魚類具有嗜中、嗜堿和嗜酸粒細胞[18]，根據特殊顆粒的結構特征，魚類嗜中性粒細胞又被分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等[15-17]。本試驗并未觀察到嗜堿性粒細胞，可能是受染色過程中緩沖液pH值影響，緩沖液pH值為6.4～6.8，嗜堿顆粒易被酸中和，被水溶解，出現脫?？瞻讌^，即嗜堿性粒細胞客觀存在但在染色過程中被破壞。此外，本試驗未觀察到的嗜中性粒細胞在許多魚類的嗜中性粒細胞中都有報道，如莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）的Ⅰ型粒細胞、鱖（Siniperca chuatsi）的Ⅱ型粒細胞[15]、海鱸（Dicentrarchus labras）的嗜異細胞[19]等。

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