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不同渥堆程度青磚茶改善小鼠胃腸道功能的研究

2019-08-10 06:38:03張岳峰曲鳳鳳陳玉瓊余志倪德江
湖北農業科學 2019年12期

唐 飛 張岳峰 曲鳳鳳 陳玉瓊 余志 倪德江

摘要:以昆明小鼠為試驗對象,研究不同渥堆程度青磚茶對小鼠胃排空及小腸推進功能和腸道菌群的作用,并結合青磚茶理化成分對小鼠胃腸道功能各指標進行了相關性分析。理化檢測表明,在曬青毛茶渥堆發酵過程中,游離氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素、EGC、EC、ECG、C、EGCG、酒石酸、蘋果酸、乳酸含量隨著渥堆發酵程度的增加而急劇下降,茶褐素、草酸、奎寧酸、琥珀酸、沒食子酸含量上升。在連續給予小鼠青磚茶提取物15 d后發現,輕發酵、適度發酵青磚茶能有效促進胃排空和小腸蠕動作用,并能顯著促進小鼠胃腸內雙歧桿菌、乳桿菌生長繁殖,抑制腸桿菌、腸球菌數量,其中適度發酵青磚茶表現更優。結合不同渥堆程度青磚茶理化結果進行相關性分析,改善小鼠胃腸道功能的物質可能為茶褐素、草酸、奎寧酸、琥珀酸、檸檬酸、沒食子酸。

關鍵詞:青磚茶;渥堆;胃排空;小腸推進;腸道菌群

中圖分類號:S571.1;S85? ? ? ? ?文獻標識碼:A

文章編號:0439-8114(2019)12-0124-06

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.029? ? ? ? ? ?開放科學(資源服務)標識碼(OSID):

Abstract: The aim of this study was to examine whether different fermentation levels of dark brick tea affected the gastric emptying, intestinal propulsion and intestinal microflora in Kunming mice by conducting correlation analysis between major chemical components of dark brick tea and gastrointestinal function of mice. Results indicated that during the fermentation process, the contents of free amino acids, polyphenols, soluble sugars, water extracts, theaflavins, thearubigins, epigallocatechin, epicatechin, catechin, epigallocatechin gallate, tartaric acid, malic acid and lactic acid were significantly decreased, while the contents of theabrowine, caffeine, oxalic acid, quininic acid, succinic acid as well as gallic acid were remarkably increased. After a consecutively 15 days intragastric administration of dark brick tea extract solution to mice, both dark brick tea fermented for 9 days and 15 days could significantly promote gastric emptying and intestinal propulsion, increase the amount of bifidobacterial and lactobacillus, as well as decrease the amount of enterobacteria and enterococcus, in which of the dark brick tea fermented for 15 days was better. Furthermore, the dark brick tea fermented for 15 days was superior to 9 days in terms of improving gastrointestinal function of mice. Correlation analysis showed the major functional components of dark brick tea might be theabrowine, oxalic acid, quininic acid, succinic acid, citric acid and gallic acid.

Key words: dark brick tea; fermentation; gastric emptying; intestinal propulsion; intestinal microflora

胃腸道功能障礙性疾病成為21世紀影響現代人生活質量的重要疾病,發病率較高,且大多數患者需要藥物治療[1]。由于藥物多具有依賴性和廣譜性,在殺死有害微生物的同時,也抑制了正常菌群中有益微生物的生長,容易造成胃腸道菌群紊亂,產生諸多不良反應[2]。因此,尋找安全有效地調節胃腸道功能且低成本的食品基料具有廣闊的前景。

青磚茶(Dark brick tea)是中國特種黑茶,主產于湖北省鄂南地區,是中國西北少數民族不可或缺的生活必需品[3]。民間早有使用青磚茶治療胃腸道的方法,也有相關研究報道青磚茶具有調節胃腸道的作用。許靖逸等[4]利用倍比稀釋法和牛津杯法對綠茶、紅茶、烏龍茶、黃茶、白茶和黑茶六大茶類抑制腸道致病菌大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的作用進行測定發現,六大茶類對腸道致病菌均有抑菌效果,抑菌效果與其內含成分有關;李世剛等[5]發現湖北青磚茶可降低腹瀉型易激綜合征模型大鼠的腸道敏感性;吳香蘭[6]研究了普洱茶、千兩茶、六堡茶、青磚茶、茯磚茶改善小鼠胃腸道功能發現,以上5種黑茶都有不同程度改善小鼠胃腸道功能作用。因此,隨著現代生活節奏加快和人們飲食結構的變化,越來越多的現代人選擇養生,選擇喝青磚茶。青磚茶產業近幾年發展迅猛,部分廠家在渥堆工藝上采用輕發酵技術生產青磚茶,但在青磚茶改善胃腸道功能方面,缺乏不同渥堆程度青磚茶對改善胃腸道功能的影響,同時也缺乏青磚茶改善胃腸道功能與內含物質相關性的報道。為此,通過灌胃小鼠營養性半固體糊食物添加黑色炭末的方法[7-9],測定小鼠胃排空率和小腸推進率以及腸道菌群數量,研究了不同渥堆程度青磚茶對小鼠胃腸道功能的影響,并進一步探討了青磚茶內含物質與胃腸道功能的相關性,為青磚茶的健康飲用和生產提供指導作用。

1? 材料與方法

1.1? 樣品

以神農架地區曬青毛茶(嫩度為帶紅梗修剪新梢)為原料,設置渥堆輕發酵和適度發酵兩個處理。渥堆試驗在人工氣候箱(RXZ-328A型)進行,渥堆葉含水量38%、溫度45 ℃、濕度85%,渥堆時間輕發酵為9 d,適度發酵為15 d。渥堆結束后在SKFG-01型電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干,得到輕發酵和適度發酵青磚茶原料。

1.2? 試驗動物

健康成年昆明種小鼠,體重(25±1) g,SPF級,由湖北省實驗動物研究中心提供,許可證號:SCXK(鄂)2015-0018。

1.3? 藥品及試劑

營養性半固體型糊的制備:10 g羧甲基纖維素鈉加奶粉16 g、蔗糖8 g、淀粉8 g、活性炭5 g溶于250 mL去離子水中攪拌均勻制成300 mL(約300 g)半固體糊狀物,冰箱冷藏,用前2 h取出,恢復至室溫。腸道菌群培養基及生產廠家如表1所示。

1.4? 主要設備

AW220型電子分析天平、RXZ-328A型人工氣候箱、SKFG-01型鼓風干燥箱、巨輪牌FZ102型植物粉碎機、SW-CJ-2FD型超凈工作臺、HH-6型數顯恒溫水浴鍋、DNP系列電熱恒溫培養箱、厭氧盒、高壓滅菌鍋、常規玻璃儀器等。

1.5? 試驗方法

1.5.1? 不同渥堆程度青磚茶水提物的主要化學成分測定? 茶多酚總量采用福林酚法[10],兒茶素組分、咖啡堿、有機酸含量采用高效液相色譜法(HPLC),氨基酸總量檢測采用茚三酮顯色法[11],水浸出物含量采用重量法[12],可溶性糖含量采用蒽酮比色法[13],茶黃素、茶紅素和茶褐素含量采用系統法[14,15]。所有試驗重復3次。

兒茶素組分及咖啡堿含量檢測的HPLC條件:用70%甲醇在70 ℃水浴中浸提樣品10 min,3 000 r/min離心10 min過0.45 μm濾膜后待測。HPLC條件:LC1200,Agilent,USA;色譜柱,Agilent TC-C18(4.6 μm×250 mm);進樣量5 μL;流速1 mL/min;溫度35 ℃;檢測波長280 nm;流動相A,去離子水(0.1%甲酸);流動相B,甲醇(0.1%甲酸);梯度洗脫條件,0~10 min,100% A;10~20 min,68%A和32%B;20~30 min,100% A。

有機酸組分含量檢測的HPLC條件:用去離子水在100 ℃水浴中浸提20 min,脫脂棉過濾,用微孔濾膜過濾。色譜柱:Agilent HB-C18,色譜條件:柱溫:30 ℃;流速:0.4 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長:210 nm;流動相A:KH2PO4,流動相B:甲醇;梯度洗脫條件,0~5 min,99%A,1%B;5~25 min,97%A,3%B;25~30 min,99%A,1%B。

1.5.2? 青磚茶水提物的制備? 稱取青磚茶茶粉,以茶水比1∶15微沸提取30 min,抽濾,旋轉蒸發濃縮,控制濃縮體積,配制成不同渥堆程度青磚茶茶湯。

1.5.3? 青磚茶水提物劑量的選擇? 參考黑茶吸收試驗人體推薦量為每人10 g(成人60 kg)每日,試驗設計劑量為人體推薦量的10倍(1 667 mg/kg)[6],另設正常對照組加入等體積去離子水。

1.5.4? 不同渥堆程度青磚茶對正常小鼠胃排空和小腸推進功能的影響? 小鼠適應飼養4 d后,開始正式試驗。取健康小鼠40只,全為雄性,隨機分為正常對照組、適度發酵組、輕發酵組、曬青毛茶組,每組10只。每組按每只0.15 mL/10 g分別灌胃,1次/d,連續給青磚茶水提物15 d;正常對照組灌胃等體積的去離子水。末次灌胃前24 h,小鼠禁食不禁水。第15 天給予青磚茶水提物后30 min,每只小鼠灌胃5%的炭末混懸液(用1%的羧甲基纖維素鈉配制)0.8 mL。灌營養性半固體糊25 min后,小鼠脫頸椎處死,取胃,濾紙拭干后稱全重,沿胃大彎剪開胃體,洗去胃內容物后拭干稱胃凈重。胃全重和胃凈重的差值為胃殘留物重,以此與所灌半固體糊的重量百分比為胃內殘留率(%)。迅速取出小鼠的胃及回盲腸部位的整段小腸,剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管,輕輕剝離后不加牽引直鋪于白紙上,鋪直后測量幽門至炭末前沿的距離,以幽門至炭末前沿的距離占幽門至回盲部全長的百分比為炭末推進百分率(%)。胃內容物殘留率=(胃全重-胃凈重)/半固體糊重×100%;炭末推進率=(炭末移動距離/腸總長度)×100%。

1.5.5? 不同渥堆程度青磚茶對正常小鼠腸道菌群的影響? 無菌采集小鼠新鮮糞便0.1~0.4 g,置于己稱重的干燥滅菌小試管中,充分震蕩,直至糞便分散均勻,再依次10 倍稀釋至10-9,4 h內完成。根據預試驗結果,選擇合適的稀釋度,分別取1 mL接種到各類選擇性培養基上并各做3個重復,EMB培養基和膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養基放入37 ℃需氧培養24~48 h后計數,BBL培養基及MRS培養基37 ℃厭氧培養24~48 h 后計數。根據菌落形態,涂片分析計算各菌群每克糞便中菌落形成數,結果以對數表示(lgCFU/g)。

1.6? 數據處理

試驗數據用Excel 2010和SPSS 18.0軟件統計處理分析。SPSS 18.0試驗數據用(x±s)表示,采用單因素方差分析,組間用兩兩比較差異法。

2? 結果與分析

2.1? 不同渥堆程度青磚茶主要品質成分測定結果

隨著發酵時間的進行,在微生物和濕熱共同作用下,曬青毛茶逐漸渥堆發酵為輕度發酵青磚和適度發酵青磚。由表2可知,游離氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素含量均隨著渥堆時間的延長呈急劇下降趨勢,茶褐素含量呈上升趨勢。其中,與曬青毛茶相比,輕發酵青磚游離氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素含量分別下降了53.30%、35.10%、45.90%、17.22%、37.50%、55.90%,茶褐素含量上升了59.29%;適度發酵青磚游離氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素含量分別下降了71.81%、82.51%、54.77%、39.71%、62.50%、91.28%,茶褐素含量上升了103.57%。且在每一種內含成分含量中,不同發酵組間均有極顯著性差異(P<0.01)。其中,曬青毛茶茶多酚含量較一般綠茶含量低很多,這與本試驗采用原料為帶紅梗新梢,比較粗老,而且存放一年有關。

由表3可知,不同渥堆時間對兒茶素和咖啡堿含量有顯著影響。渥堆至15 d時,在適度發酵青磚茶中GC、ECG、EC未能檢出。隨著發酵時間的增加,青磚茶EGC、C、EGCG含量極顯著降低(P<0.01),與曬青毛茶相比,發酵9 d分別極顯著降低35.53%、28.89%、93.53%,發酵15 d分別極顯著降低95.49%、91.85%、99.60%。盡管曬青毛茶在發酵9 d后GC含量略微增加,但發酵15 d后含量降低至未檢出,說明GC在發酵后期消耗大于產生。與之相反的是,CG含量在發酵9 d后極顯著增加,但隨著發酵時間的增加無顯著變化,可能發酵9 d GC含量已達峰值??Х葔A含量隨發酵程度的深入而呈現上升趨勢,這與茶葉渥堆有關。渥堆過程由于濕熱作用以及微生物作用,伴隨著物質的分解與散失,渥堆結束后損失率一般在20%~35%,總重量減少,而咖啡堿是相對比較穩定的物質,因而含量升高[16]。

由表4可知,在不同渥堆程度青磚茶有機酸組分中,α-酮戊二酸、乙酸含量均未檢出,曬青毛茶中奎寧酸未檢出,適度發酵青磚茶中富馬酸未檢出。蘋果酸、乳酸含量隨發酵時間的增加而極顯著減少(P<0.01),而草酸、奎寧酸、琥珀酸隨發酵時間增加而極顯著增加。此外,與曬青毛茶相比,發酵9 d與15 d青磚茶的檸檬酸含量、沒食子酸含量顯著增加(顯著性分別為P<0.01、P<0.05),但輕發酵青磚茶的檸檬酸含量極顯著高于適度發酵青磚茶。輕發酵青磚茶和適度發酵青磚茶有機酸總量較曬青毛茶分別提高了1.10、1.32倍,與之前研究結果較為一致[17,18]。

2.2? 不同渥堆程度青磚茶水提物對小鼠胃排空的影響

由表5可見,連續15 d 給予小鼠不同渥堆程度青磚茶水提物后,與空白對照組相比,適度發酵青磚茶小鼠胃內容殘留率顯著下降了28.77%,曬青毛茶組與輕發酵青磚茶對小鼠胃排空功能無顯著影響,即P>0.05。然而從不同渥堆程度角度分析結果表明,與曬青毛茶組相比,輕度發酵青磚茶能顯著降低胃殘留率(P<0.05),適度發酵青磚茶能極顯著降低胃殘留率(P<0.01),說明發酵時間的增長利于小鼠胃排空作用,原因可能是隨著曬青毛茶發酵時間的延長,內含物質之間相互轉化,改善小鼠胃pH,增強了小鼠胃的消化吸收功能。

2.3? 不同渥堆程度青磚茶水提物對小鼠小腸推進的影響

由表6可見,在給小鼠連續灌胃不同渥堆程度青磚茶水提物15 d以后,小鼠的小腸推進能力發生了明顯變化。與空白對照組相比較,曬青毛茶組小鼠的小腸推進率略微減少了7.62%(P>0.05),輕發酵組和適度發酵組青磚茶小鼠的小腸推進率分別顯著提高了18.83%、26.49%。從不同渥堆程度青磚茶組差異來看,曬青毛茶組與輕度發酵組、適度發酵青磚茶組均達到極顯著性差異,即P<0.01。結果表明,輕度發酵茶組、適度發酵青磚茶均能改善小鼠小腸推進能力,而曬青毛茶作用不明顯,說明曬青毛茶隨著發酵時間的增加,對小鼠小腸推動作用越來越明顯,以適度發酵(15 d)較優。

2.4? 不同渥堆程度青磚茶水提物對小鼠腸道菌群的影響

不同渥堆程度青磚茶對小鼠連續灌胃15 d后,無菌采集小鼠糞便檢測腸道各菌群變化情況如表7。與空白對照組相比,輕發酵青磚茶和適度發酵青磚茶均能顯著促進有益菌雙歧桿菌、乳桿菌的生長,抑制有害菌腸球菌、腸桿菌的增殖,但輕發酵組與適度發酵組無顯著性差異。曬青毛茶對小鼠腸道菌群的變化無顯著影響。說明曬青毛茶經過發酵后,內含物質的轉變有利于改善腸道微生物環境。

2.5? 不同渥堆程度青磚茶主要理化成分與小鼠胃腸道功能相關性分析

人體蛋白的分解多在胃和小腸中進行,小腸和胃中的蛋白酶可由胰蛋白酶激活酶原而釋放出有活性的蛋白酶, 因此在攝入含有較高濃的緊壓茶汁后, 通過提高胰蛋白酶活性,同時激活小腸和胃的蛋白酶,加快食物的分解和吸收。丁玲[19]研究了茯磚茶加工過程中主要化學成分與胰酶激活反應值相關性分析發現,具有顯著性相關的因素為兩組,一組為多酚類物質,另一組為有機酸類。陳文峰等[20]研究了緊壓茶中茶多酚、有機酸與蛋白酶活力的相關性發現,茶多酚含量與蛋白酶活力相關系數為0.937 3,酸性物質含量與蛋白酶活力相關系數為0.489。對不同渥堆程度青磚茶理化成分與小鼠胃腸道功能各指標進行相關性分析,由表8可知,小鼠胃殘留率、腸桿菌、腸球菌與不同發酵青磚茶中茶褐素、草酸、奎寧酸、琥珀酸、檸檬酸、沒食子酸、有機酸總量極顯著負相關,與游離氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素、EGC、EGCG、兒茶素總量、蘋果酸極顯著正相關。而小腸推進率、乳桿菌、雙歧桿菌與茶褐素、草酸、奎寧酸、琥珀酸、檸檬酸、沒食子酸、有機酸總量極顯著正相關,與游離氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素、EGC、EGCG、蘋果酸極顯著負相關。

3? 討論

青磚茶屬于后發酵的黑茶類,是以成熟新梢為原料,先加工成曬青毛茶,然后經過渥堆發酵、干燥、再拼配、蒸壓成型、低溫長烘、陳化等工序,形成青磚茶獨特的品質特征,渥堆發酵是青磚茶品質形成的關鍵工序。在這個過程中,曬青毛茶同時受到濕熱、微生物和酶的作用,內含成分較曬青毛茶發生了顯著變化[20-22]。從本試驗結果來看,主要表現在游離氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素、EGC、EC、EGC、C、EGCG、酒石酸、蘋果酸、乳酸含量隨著渥堆時間的延長顯著下降,茶褐素、咖啡堿、草酸、奎寧酸、琥珀酸、沒食子酸含量顯著上升。因此,不同渥堆程度青磚茶對小鼠胃腸道功能的影響有較大差異。輕發酵青磚茶、適度發酵青磚茶對小鼠胃排空、小腸推進作用明顯,能顯著促進有益菌雙歧桿菌、乳桿菌的生長繁殖,抑制有害菌腸球菌、腸桿菌的生長繁殖,提示青磚茶具有改善小鼠胃腸道功能。同時,適度發酵青磚茶效果優于輕發酵青磚茶,而曬青毛茶未起積極作用。

青磚茶改善小鼠胃腸道功能的活性物質可能是某幾種物質互作效果。岳隨娟等[23]通過灌胃茶褐素后發現,茶褐素能促進大鼠腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌增殖,抑制大腸桿菌、腸球菌生長的作用。李俊良等[24]研究了檸檬酸對肉仔雞生長性能、腸道菌群等相關指標的影響發現,檸檬酸處理組腸道乳酸菌含量有升高趨勢,大腸桿菌含量有降低趨勢,并能改善小腸黏膜絨毛形態結構。翁蔚等[25]研究了不同發酵時間綠茶汁產物(乙醇、有機酸和茶多酚)的抑菌作用發現,綠茶汁發酵產物對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌兩種有害菌也有著明顯的抑制效果,對乳酸桿菌有一定促生的作用,而發酵時間的延長會進一步增強促生作用。虞希沖等[26]人發現茶氨酸能抑制攝食和胃排空作用,可能與抑制下丘腦外側核的NMDA受體和AMPA受體有關。史先振等[27]、朱建鵬[28]分別發現木糖、健胃消食片原材料浸膏中多糖組分對胃腸道功能有一定的作用。于玲等[29]對含有較多多酚類物質的葡萄酒釀造工藝研究中發現微生物發酵多酚類物質可產生較多的有機酸,并且那淑敏等[30]發現茶多酚和有機酸兩者都能對腸胃道消化功能起促進作用。上述文獻說明了茶多酚和有機酸能抑制致病菌的生長,促進有益菌的增殖,而在本試驗中發現茶多酚含量較高(8.29%)的曬青毛茶改善小鼠腸道微生物環境并不明顯,且在試驗中發現有個別小鼠胃脹氣現象,有可能是因為茶多酚含量過高,小鼠腸胃受到刺激,胃黏膜損傷。因此結合不同渥堆程度青磚茶理化成分與胃腸道指標相關性分析可知,不同發酵青磚茶中茶褐素、咖啡堿、草酸、奎寧酸、琥珀酸、檸檬酸、沒食子酸與小鼠胃殘留率、腸桿菌、腸球菌極顯著負相關,與小鼠推進率、乳桿菌、雙歧桿菌極顯著正相關。由此推斷,不同渥堆程度青磚茶改善小鼠胃腸道功能的物質為茶褐素、檸檬酸、奎寧酸、琥珀酸、沒食子酸等,且可以推斷這幾種化合物具有一定的互作效果。

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收稿日期:2018-08-16

作者簡介:唐? 飛(1989-),男,湖南邵陽人,碩士研究生,研究方向為茶葉加工與功能化學,

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