稻蝦共作對稻田土壤反硝化細菌nosZ基因數量、多樣性及群落結構的影響

王蓉　龔世飛　金濤　劉章勇

摘要：對稻蝦共作模式下水稻土壤反硝化細菌群落進行研究，以期揭示稻蝦復合種養模式下土壤反硝化細菌豐度、群落多樣性及組成，為科學研究稻蝦共作模式的土壤微生物多樣性，維持土壤地力提供理論依據。依托長江大學農學院基地設置常規中稻種植模式（MR）、稻蝦共作模式（CR）等2種模式，利用熒光定量PCR和高通量測序平臺比較2種模式下水稻土壤反硝化細菌nosZ基因的數量、群落多樣性及群落組成。結果表明，稻蝦共作顯著提高水稻土壤硝態氮、全碳、全氮含量，對堿解氮含量、pH值、碳氮比及銨態氮含量無顯著影響。nosZ基因在MR、CR處理中的基因豐度分別為1 g干土1.51×106、2.23×106拷貝數，CR處理中nosZ基因豐度是MR的1.48倍。CR處理顯著提高了土壤nosZ基因的豐度。通過對α群落多樣性指數進行方差分析可知，CR處理與MR處理間微生物群落多樣性差異不顯著。經韋恩（Venn）分析，在目和科水平上，MR處理與CR處理的微生物群落組成顯示出較高的相似度，在屬與種水平上，2個處理下的土壤微生物群落結構存在差異性，CR處理下的土壤缺失沼澤紅假單胞菌。經冗余分析，土壤總碳（TC）含量對nosZ基因群落結構的影響最為顯著，其次是pH值、堿解氮含量、硝態氮含量與銨態氮含量。綜合分析，稻蝦共作可顯著提高水稻土壤nosZ基因豐度，稻蝦輪作對群落多樣性的影響較小，其在種水平上缺失了沼澤紅假單胞菌。常規中稻種植模式與稻蝦共作模式下的土壤微生物群落結構雖保有一定的相似度，但仍存在差異，土壤總碳含量是影響群落結構差異的主要原因。

關鍵詞：稻蝦共作;反硝化作用;熒光定量;高通量測序技術;α群落多樣性;nosZ基因

中圖分類號： S154.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0246-06

反硝化作用作為土壤氮循環的組成部分，在土壤氮素轉化中占據重要地位[1-2]。反硝化過程在厭氧的條件下由微生物驅動，可產生氧化亞氮（N2O），被認為是土壤釋放N2O的主要過程[3-7]，主要指硝化作用產生的硝酸根（NO3-）最終被還原成氮氣（N2）的過程，中間過程會產生一氧化碳（NO）和N2O等氣體，造成氮素損失，并引起一系列環境問題[8-10]。反硝化過程分為4個部分[11]：第1步在由nar或narp基因編碼的硝酸鹽還原酶的催化作用下，將硝酸鹽（NO3-）還原成亞硝酸鹽（NO2-）;第2步反應是在由nirK基因或nirS基因編碼的亞硝酸鹽還原酶的催化作用下，將亞硝酸鹽還原成NO;第3步反應在由norB基因編碼的一氧化氮還原酶的催化作用下，將NO還原為N2O，此步可將氮素以氣態的形式排放;第4步是在由nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶的催化作用下，將N2O還原為N2。由于氧化亞氮還原酶是控制N2O排放的主要調節因子，是完全脫氮途徑最后一步的重要催化劑，因此nosZ基因通常被用作研究反硝化群落的遺傳標記。稻田是重要的農業用地，其中約70%位于亞熱帶和熱帶地區，同時也是N2O的主要來源[12]。與旱地土壤不同，常年淹水的稻田土壤提供的厭氧條件有利于反硝化作用的發生[13]。稻蝦種養是將水稻種植與克氏螯蝦養殖相結合組成的互利共生復合生態農業系統，是稻田綜合種養模式之一。該模式實現了一水兩用、一田雙收，在節約稻田水土資源的同時帶來可觀的經濟效益[14]。當前，我國農業正面臨著資源與環境約束加劇和農民增收難度加大的難題，稻蝦生態種養高效模式的興起，被農業部譽為“現代農業的一次革命”，很快在長江中下游地區獲得大面積的推廣種植。截至2016年，稻蝦種養模式在江漢平原推廣面積已經達到20萬hm2以上[15]。統計顯示，全國適合稻蝦種養模式的稻田面積高達450萬hm2[16]。稻蝦種養模式面積逐年擴大，但國內外關于稻蝦種養模式下參與稻田土壤反硝化反應微生物的研究較少。通過研究微生物種群數量和群落結構，可以明確稻蝦土壤反硝化過程的作用機制及影響因素。本試驗以江漢平原典型稻蝦種養區湖北省荊州市為研究對象，研究該模式下土壤反硝化微生物的變化特征，以期揭示稻蝦種養模式土壤微生物群落結構和多樣性的變化規律，豐富稻蝦種養模式反硝化微生物理論，同時為該地區土地利用改良、農業結構戰略性調整以及發展稻蝦種養高產高效生態友好型農業提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗地位于湖北省荊州市長江大學農學院基地（地理位置30°6′ N，111°54′ E）。該地區處于江漢平原地帶，具有四季分明、雨熱同季、年降水量充沛等特點，冬季受極地大陸氣團影響，氣溫偏低，降水量少;夏季受熱帶海洋氣團影響，高溫多雨，水分季節分配不均，屬于亞熱帶季風氣候區，年均降水量在1 100 mm左右，無霜期200 d。土壤類型為潮土，土壤母質為河流沖積物。供試土壤全氮、全磷、速效鉀含量分別為0.75 g/kg、0.54 g/kg、17.09 mg/kg，有機質含量為38.8 g/kg，pH值為7.5。

試驗設置常規中稻種植模式（MR）與稻蝦共作模式（CR），本研究自2015年開始，連續開展2年，于中稻抽穗期采集土壤樣品作為研究對象。試驗小區由長12 m、寬5 m的田埂圍成，每個處理3次重復，為防止小龍蝦逃出，田埂加高加固并在田埂周圍鋪設塑料膜。水稻品種為隆兩優華占，小龍蝦品種為克氏原鰲蝦，施肥量采用當地習慣用量，年均施肥量為氮肥180 kg/hm2、磷肥75 kg/hm2、鉀肥105 kg/hm2，以尿素（含N 46%）、過磷酸鈣（含P2O5 12%）、氯化鉀（含K2O 60%）的形式施用。氮肥按基肥：蘗肥：穗肥=5 ∶ 2 ∶ 3施用，磷肥用作底肥1次基施，鉀肥按照50%基肥、50%追肥的方式施肥。2種模式水稻期間田間水分管理為前期灌水、中期曬田、后期干濕交替的模式。蝦田于每年水稻收獲后覆水泡田，隨即投放蝦苗，投放密度約為20萬只/hm2，來年4月至6月上旬捕撈成蝦，捕撈完成后開始整體準備中稻的移栽，等待水稻收獲后進行下一輪的小龍蝦養殖。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品在水稻抽穗期采集，用于基本理化性質分析與土壤微生物測定。采用不銹鋼土鉆按照5點采樣法采集用于測定土壤基本理化性質的土樣，重復3次，將土樣帶回實驗室剔除石子、根系等雜物，存放在陰涼處混勻風干，待土樣風干磨碎后分別過20目與100目篩用于室內分析。用谷物采樣器采集用于測定水稻土壤微生物的樣品，每個處理重復3次，樣品采集后剔除石子與根系，然后立即放入錫箔紙中包裹，存放在液氮罐中，并帶回實驗室存放于-80 ℃冰箱備用。

1.3 土壤基本理化性質測定

土壤基本理化性質分析參考鮑士旦的方法[17]。土壤全氮、全碳含量采用ECS4024元素分析儀（意大利Costech公司）測定;土壤堿解氮含量測定采用堿解擴散法;土壤硝態氮含量采用 2 mol/L KCl溶液浸提并在203、270 nm下測定;銨態氮含量測定采用靛酚藍比色法;pH值測定采用電位法（水與土質量比為2.5 ∶ 1）。

1.4 土壤總DNA提取

取0.25 g低溫保存的土壤樣品，用PowerSoil DNA Isolation Kit（美國Mobio公司） DNA試劑盒提取土壤總DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA，并用NanoDrop ND-1000UVevis分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）檢測提取的DNA濃度與純度。

1.5 反硝化微生物nosZ基因擴增與熒光定量PCR分析

用引物對[18]nosZF（CGYTGTTCMTCGACAGCCAG）和nosZ-1622R（CGSACCTTSTTGCCSTYGCG）擴增nosZ基因。PCR反應體系總體積為20 μL，包括：10 μL 2×syberMIX，0.2 μL 的2種上、下游引物（10 μmol/L），1 μL稀釋8倍后的樣品，最后用無RNA酶的ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸55 s，32個循環;72 ℃終延伸10 min，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

標準曲線的制備：將PCR產物純化回收后，選取熒光假單胞菌的nosZ基因陽性克隆轉接過夜培養，質粒濃度經分光光度計測定后，按照10倍梯度逐漸將質粒稀釋至103～108拷貝數，-80 ℃低溫保存。

熒光定量PCR反應在ABI7500熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）上進行，引物序列前文已標出，反應體系總體積為25 μL，包括2×SYBER Green 12.5 μL，上下游引物各 0.8 μL，ROX 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O補至 25 μL，試驗試劑購寶生物工程（大連）有限公司。

1.6 高通量測序

擴增產物經切膠純化后連接至pUC-T載體上，轉至大腸桿菌DH5α中進行培養，選用陽性克隆進行測序，序列提交至NCBI數據庫進行比對，并將同源性大于等于97%的序列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）聚類。

1.7 數據處理與作圖

利用SPSS 22.0對土壤基本理化性質數據進行方差分析;采用CANOCO 5.0軟件對土壤基本理化性質與反硝化微生物nosZ基因群落結構進行冗余分析（redundancy analysis，簡稱RDA），使用Mothur1.30.1在同源性達97%上進行群落多樣性指數分析，nosZ基因數量采用Excel軟件作圖，R語言繪制曲線與相關熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理下土壤基本理化性質

稻蝦共作處理顯著影響了部分土壤基本理化性質（表1）。方差分析結果表明，除土壤堿解氮含量、pH值、銨態氮含量及碳氮比（C/N）無顯著變化外，稻蝦共作顯著增加了土壤硝態氮、全碳、全氮的含量。相比常規中稻種植模式，硝態氮含量提升了29.03%，全碳含量增加了2.37%，全氮含量提升了4.30%，對土壤pH值、堿解氮含量、銨態氮含量及C/N無顯著影響。

2.2 測序結果及多樣性指數

采用Miseq技術對微生物nosZ基因進行測序分析，數據經過優化篩選后，6個樣品共測得原始序列218 108條，序列平均長度為407.74 bp，共測得堿基88 937 543個， 所有樣品的序列長度在218～552 bp之間（表2）。按97%的相似度對非重復序列進行OTU分析，共得到344個OTUs。對各樣本序列采用隨機抽樣方法進行抽樣，以抽到的序列數與它們對應的物種多樣性指數，構建稀釋曲線。由圖1可知，樣本覆蓋度（coverage）指數為0.998 2～0.999 2，稀釋性曲線均趨于平坦飽和，表明此測序深度獲得的序列數據量可以反映土壤樣品nosZ基因微生物信息。

對α多樣性指數進行單因素方差分析，結果（表3）顯示，2個處理間多樣性指數差異不顯著（P<0.05）。MR處理的Ace指數、Chao指數、香濃（Shannon）指數、Sobs指數均高于CR處理，差異不顯著;MR處理的辛普森（Simpson）指數低于CR處理，差異不顯著。多樣性分析結果表明，稻蝦種養模式（CR）沒有顯著改變nosZ基因微生物群落豐富度及群落多樣性。

2.3 稻蝦種養對土壤nosZ基因豐度的影響

利用熒光定量技術對氧化亞氮還原酶nosZ基因進行定量分析，結果（圖2）表明，CR處理nosZ基因豐度顯著高于MR處理。其中CR處理中nosZ基因豐度為1 g干土2.23×106拷貝數，MR處理中nosZ基因豐度為1 g干土1.51×106拷貝數，CR處理nosZ基因豐度是MR處理基因豐度的1.48倍。與常規中稻種植模式相比，稻蝦種養模式可以顯著提升稻田土壤nosZ基因豐度。

2.4 稻蝦種養對土壤中nosZ基因物種組成的影響

在水稻抽穗期，對CR處理和MR處理nosZ基因微生物進行目、科、屬、種的物種分類學水平韋恩（Vern）分析，結果見圖3。在目和科水平上，CR處理和MR處理具有相同的10個目（圖3-a）和12個科（圖3-b），在目和科水平的群落組成上表現出極大的相似性;在屬水平上，CR處理和MR處理有17個相同的屬，MR處理獨有紅假單胞菌屬（圖3-c）;在種水平上，CR處理和MR處理有19個相同的種，MR處理獨有沼澤紅假單胞菌（圖3-d）。分析表明，在科水平以上，稻蝦種養模式（CR）nosZ基因微生物群落組成與常規稻田表現出極大的相似性，在屬和種水平上，2個處理之間的微生物群落組成存在差異，稻蝦種養模式（CR）缺失紅假單胞菌屬下的沼澤紅假單胞菌。

2.5 稻蝦種養模式對nosZ基因物種目水平相對豐度的影響

樣品獲得的nosZ基因微生物物種分類在2個域、2個界、4個門、6個綱、10個目、12個科、18個屬和20個種。將無法分類的序列定義為無法歸類，樣品獲得的nosZ基因OTUs在分類學界、門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類比例為 95.0%、95.0%、90.0%、85.0%、75.0%、50.0%、35.0%。

在目水平上，未分類c_β-變形菌目、未分類_p_變形菌目、嗜氫菌目、紅環菌目、未分類_k_norank d_細菌目、根瘤菌目是2個處理平均相對豐度同時大于1%的6個優勢菌目（圖4），CR處理3次重復平均相對豐度分別為52.45%、29.49%、6.72%、5.57%、2.91%、1.82%;MR處理3次重復平均相對豐度分別為58.43%、15.57%、8.85%、9.77%、2.98%、2.40%。對nosZ目水平上相對豐度大于>0.1%的群落物種進行顯著性分析，結果（表4）顯示，紅環菌目在CR處理中的相對豐度顯著低于MR處理（P<0.05），norank_p_environmental_samples在CR處理中的相對豐度顯著高于MR處理（P<0.05）。稻蝦種養模式顯著降低了紅環菌目的相對豐度，增加了norank_p_environmental_samples的相對豐度，改變了nosZ基因微生物目水平相對豐度的組成。

2.6 nosZ型反硝化細菌群落結構與土壤理化性質的相關性

對97%相似水平上的OTU代表序列進行決策曲線分析法（decision curve analysis，簡稱DCA）進行分析，看分析結果中lengths of gradient 的第一軸的大小，如果大于4.0，就應該選典型關聯分析（canonical correlation analysis，簡稱CCA），如果介于3.0～4.0之間，選RDA和CCA分析均可，如果小于3.0，RDA分析優于CCA分析。分析結果中lengths of gradient第一軸的大小為0.553，因此選用RDA分析環境因子、樣本、菌群三者間的關系。

對nosZ群落結構與土壤理化性質進行冗余分析，結果（圖5）表明，2個排序軸共解釋了98.35%的變化，第一排序軸（RDA1）解釋了95.56%的群落變化，第二排序軸（RDA2）解釋了2.79%的變化。第一排序軸與土壤全碳（TC）含量、pH值、硝態氮（NO3--N）含量的關系最為密切，第二排序軸與土壤堿解氮（AN）含量的關系最為密切。總體而言，土壤全碳（TC）含量對群落結構的影響最為顯著（R2=0.482 8），影響順序依次是土壤總碳含量>pH值>堿解氮含量>硝態氮含量>銨態氮含量。沿第一排序軸看，稻蝦種養的3個樣本全部分布在常規中稻處理左側，其中CR2、CR3分別與常規中稻的MR1、MR2、MR3樣本距離較近，而CR1處理與其他樣本距離較遠。表明2個處理群落結構存在差異，但稻蝦種養模式與常規稻田模式在群落結構上仍保留著一定的相似性，土壤總碳含量是影響2種模式群落結構的主效因子。

3 討論與結論

佀國涵等研究表明，長期稻蝦輪作顯著提高水稻土0～40 cm 耕層有機碳、全鉀、堿解氮含量，0～30 cm耕層的土壤全氮含量及0～10 cm土壤速效鉀、全磷含量在稻蝦輪作下也顯著提高，該模式可改善土壤結構增加土壤養分[19]。金乃康研究結果顯示，稻蝦種養模式下蝦子的糞便可增強土壤肥力，減少化肥使用量，在降低生產投入的情況下又可提高農田利用效率與經濟效益[20]。本研究的結果與前人研究基本一致，與常規中稻種植模式相比，稻蝦輪作模式顯著提高了土壤全氮、全碳、硝態氮含量。目前，稻蝦稻田種養復合模式的研究多數集中在土壤物理化學性質、稻蝦田溫室氣體以及稻蝦種養技術等方面，對于稻蝦土壤反硝化微生物方面的研究較少。研究結果表明，稻田養蝦對nosZ基因微生物群落豐富度及群落多樣性的影響均不顯著。稻蝦種養模式與常規中稻種植模式nosZ基因微生物群落結構存在差異，但二者在群落結構上仍保留著一定的相似性。該結果與之前的研究發現一致，在不同的土地利用方式、不同環境條件下，nosZ基因的微生物群落組成變化不大，nosZ基因微生物群落在土壤中相對比較穩定，受到環境條件影響的變化不大[21-22]。在中稻抽穗期，稻蝦種養模式nosZ基因豐度是常規中稻種植模式的1.48倍，顯著提升了稻田土壤中nosZ基因的豐度。稻蝦種養模式顯著提升了土壤中硝態氮含量，而NO3--N是反硝化反應第1步硝酸還原反應的底物，反應生成的N2O是nosZ基因編碼的N2O還原酶的原料，能夠促進nosZ的增長。所以，硝態氮間接地為nosZ基因微生物提供了原料，促進了nosZ基因豐度的增加[9]。沼澤紅假單胞菌是一種菌體富含蛋白質、維生素、類胡蘿卜素等營養物質，被廣泛應用于漁業的光合細菌，作為飼料添加劑可以有效地提高飼料效率，促進魚蝦生長[23]。沼澤紅假單胞菌和紅螺菌同屬紅螺菌科，二者生存條件相似，均是在光照和厭氧條件下適宜生長[24]。稻蝦種養模式缺失沼澤紅假單胞菌可能與缺失紅螺菌的原因相似，一方面是抽穗期株高較高，遮光效應不利于沼澤紅假單胞菌的生長;另一方面可能在淺水狀態下，克氏螯蝦的擾動帶入了水體氧氣，打破了厭氧環境，不利于沼澤紅假單胞菌的生長[25]。Miller等在研究短期內（72 h）碳源對小麥反硝化基因豐度的影響發現，碳含量較高是氮施入可以提高反硝化微生物豐度的前提[26]。自然界中多種環境因素，如土壤pH值[27]、土壤含氧量[28-29]、土壤溫度[30]、土壤含水量[31]、土壤中的養分供應狀況[32]以及植物種類[33-34]等均能夠影響反硝化細菌群落的結構。續勇波等認為，凡是能促進土壤碳、氮積累和厭氧微生物活性的土地利用方式和耕作管理措施均會促進反硝化作用進行，可見碳、氮是影響反硝化活性的主要因子[35]。本研究結果顯示，土壤總碳是影響2種模式nosZ基因微生物群落結構的主效因子，與前人的研究結果基本一致。此外，由于稻蝦田土壤的環境較為復雜，須經歷干濕交替階段，且受水稻植株根系分泌物的影響，因此對于稻蝦土壤反硝化細菌群落的研究也就更為復雜，須要更加深入系統的研究。

本研究結論如下：（1）相比常規中稻種植模式，稻蝦共作顯著增加了水稻土壤硝態氮、全碳、全氮含量，對土壤pH值、堿解氮含量及土壤碳氮比無顯著影響。（2）本研究借助熒光定量PCR對常規中稻種植模式與稻蝦共作模式下的土壤反硝化細菌nosZ基因數量進行研究，結果表明，稻蝦共作模式中nosZ基因豐度顯著高于常規中稻種植模式。（3）與常規中稻種植模式相比，稻蝦種養模式沒有顯著改變nosZ基因微生物群落豐富度及群落多樣性。在目和科水平以上，稻蝦種養模式nosZ基因微生物群落組成與常規稻田表現出極大的相似性;在屬和種水平，2個處理微生物群落組成存在差異，稻蝦種養模式缺失紅假單胞菌屬下的沼澤紅假單胞菌。2種種植模式群落結構存在差異，但稻蝦種養模式與常規稻田種植模式在群落結構上仍保留著一定的相似性。與常規中稻種植模式相比，稻蝦種養模式顯著降低了紅環菌目的相對豐度，改變了nosZ基因微生物目水平相對豐度的組成。此外，土壤pH值、堿解氮含量、硝態氮含量、銨態氮含量與群落結構存在顯著相關關系，而土壤總碳含量是影響2種模式nosZ基因微生物群落結構的主效因子。

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