湖南省部分規(guī)模豬場保育仔豬細(xì)菌感染調(diào)查及藥敏檢測分析

龍 劍，張古月，余俊達(dá)，卿任科，李潤成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化、集約化的不斷發(fā)展，以及養(yǎng)豬生產(chǎn)中免疫抑制性因素增加，豬的細(xì)菌性疾病日益嚴(yán)重，大腸桿菌（Escherichia coli,E.coli）、豬鏈球菌（Streptococcus suis,SS）、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）、巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）等已經(jīng)成為影響規(guī)模豬場生豬生長的主要細(xì)菌病原，嚴(yán)重威脅著豬場的健康生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益[1]。2013—2017年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疾病診斷中心對9 961個豬場的47 175份樣本進(jìn)行細(xì)菌分離，檢測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性感染以 E.coli、SS、HPS、Pm 為主，其中HPS與SS成為我國養(yǎng)豬業(yè)的主要致病菌[2]。而保育仔豬由于自身免疫力低下，更容易受到細(xì)菌性病原的感染，因此，科學(xué)預(yù)防和控制保育仔豬的細(xì)菌性疫病，成為了促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一個重要課題。

為調(diào)查湖南省規(guī)模豬場保育仔豬細(xì)菌感染及藥物敏感情況，文章對2018年湖南懷化、郴州、常德等地10個規(guī)模豬場，80頭病、死保育仔豬的425份病料進(jìn)行細(xì)菌分離、PCR鑒定及藥敏試驗，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2018年，從湖南懷化、郴州、常德等地10家規(guī)模豬場，采集80頭臨床表現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難、體溫升高、食欲不振、精神抑郁，神經(jīng)癥狀等病、死保育仔豬樣本，每頭包括肺、脾、腎、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等。

1.2 培養(yǎng)基

TSB、LB、BHI培養(yǎng)基均購于Oxoid公司；巧克力營養(yǎng)瓊脂平板購于貝瑞特公司；鮮血營養(yǎng)瓊脂平板購于江門公司。

1.3 主要試劑

小牛血清購買于益康生物公司；革蘭氏染色試劑及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購買于北京索萊寶科技有限公司；即用型PCR試劑盒3.0（MIX）及DNA提取試劑盒購買于北京天恩澤生物技術(shù)有限公司；DL 2 000 DNA Marker購于康為世紀(jì)公司；藥敏紙片購買于杭州微生物公司。

1.4 引物合成

E.coli、SS、HPS、Pm 鑒定引物參照文獻(xiàn)[3-6]的方法由擎科生物技術(shù)有限公司合成。各引物信息見表1。

表1 各細(xì)菌鑒定引物信息

1.5 細(xì)菌分離及鑒定

1.5.1 細(xì)菌分離與鏡檢 無菌取病變組織或關(guān)節(jié)液劃線接種于巧克力培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)36 h，根據(jù)平板上細(xì)菌生長情況及菌落形態(tài)，從形態(tài)相同、數(shù)量上具有優(yōu)勢的菌落群中，挑取單菌落分離純化、涂片鏡檢。然后，根據(jù)疑似菌種，選擇特定類型的液體培養(yǎng)基37℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)12 h增菌培養(yǎng)。

1.5.2 細(xì)菌鑒定 按照試劑盒操作說明提取DNA做為模板，并按照疑似菌種情況，選擇PCR引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系均為20 μL，包含10μL mix，7 μL 蒸餾水，引物 2 μL，DNA 模板 1 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，參照表1退火溫度退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃再次延伸7 min。PCR結(jié)束后，取5 μL于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.6 藥敏試驗

使用K-B法對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗，將培養(yǎng)好的各優(yōu)勢菌株用無菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛?，吸?00 μL稀釋菌液用涂布器均勻涂于巧克力平板上，待平板上菌液干燥后將藥敏試紙輕輕貼在巧克力瓊脂上，于37℃溫箱培養(yǎng)12～36 h（根據(jù)細(xì)菌種類確定具體培養(yǎng)時間）后記錄抑菌環(huán)的直徑并根據(jù)其結(jié)果判斷分離菌株對不同藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與鏡檢

通過細(xì)菌生長形態(tài)和革蘭氏染色初步鑒定，主要優(yōu)勢菌株代表性革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見圖1—圖4。

圖1 疑似大腸桿菌

圖2 疑似豬鏈球菌

圖3 疑似副豬嗜血桿菌

圖4 疑似豬巴氏桿菌

2.2 PCR鑒定

將不同優(yōu)勢菌株根據(jù)鏡檢疑似情況，選用相應(yīng)鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定。代表性鑒定結(jié)果見圖5—圖8。可見不同引物均有擴(kuò)增出特異性的條帶（E.coli特異性條帶為264 bp、SS為657 bp、HPS為821 bp、Pm 為 460 bp）。

圖5 E.coli樣品PCR產(chǎn)物電泳

圖6 SS樣品PCR產(chǎn)物電泳

圖7 HPS樣品PCR產(chǎn)物電泳

圖8 Pm樣品PCR產(chǎn)物電泳

2.3 細(xì)菌分離統(tǒng)計

檢測到 E.coli、SS、HPS、Pm 的陽性頭數(shù)分別為42頭、39頭、24頭、12頭，分別占比 52.5%（42/80）、48.8%（39/80）、30.0%（24/80）、15.0%（12/80），其中 2種及2種以上細(xì)菌混合感染39頭，占48.8%（39/80），具體分離情況見表2。

表2 湖南10個規(guī)模豬場采集樣本數(shù)及細(xì)菌感染情況

2.4 藥敏試驗結(jié)果

對分離到的 E.coli（7株）、SS（10株）、HPS（7株）、Pm（5株）進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果見表3。細(xì)菌對大部分常見抗生素都有一定的耐藥性，其中SS、HPS、Pm對阿莫西林、恩諾沙星、多西環(huán)素、頭孢曲松和氟苯尼考較為敏感，對鏈霉素、林可霉素耐藥嚴(yán)重；而E.coli表現(xiàn)出很強的耐藥性，僅對恩諾沙星、頭孢曲松、大觀霉素、慶大霉素較為敏感，部分分離株對常用藥物均耐藥。

表3 分離菌對12種常見抗生素的敏感性比例 %

3 討論

調(diào)查結(jié)果表明，湖南規(guī)模豬場保育仔豬細(xì)菌感染以 E.coli、SS、HPS、Pm 為主，其中鏈球菌在 10 個豬場均分離為陽性，豬場陽性率最高，其次為大腸桿菌、然后依次為副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌。分離菌中多數(shù)SS、HPS、Pm對阿莫西林、恩諾沙星、頭孢曲松、多西環(huán)素、氟苯尼考較為敏感，但20%的SS、Pm對氟苯尼考已形成耐藥，10%SS對阿莫西林、恩諾沙星以及14.3%的HPS對恩諾沙星產(chǎn)生耐藥。E.coli作為常見的耐藥菌之一，對大部分藥物耐受甚至部分菌株對常用藥物均已形成耐藥，這與何啟蓋調(diào)查研究相符[2]。同時，有部分樣品未分離到任何細(xì)菌，但不說明沒有細(xì)菌感染，這與病料樣品的保存與病、死前是否大量使用抗生素等因素有關(guān)。

正常情況下，大部分細(xì)菌對動物機體無害，屬條件性致病菌。梁媛對2008—2010年廣西65家規(guī)模豬場引起呼吸道細(xì)菌性疾病調(diào)查結(jié)果表明，單純細(xì)菌感染不易引發(fā)豬只呼吸道疾病，常與豬繁殖與呼吸綜合征或豬圓環(huán)病毒2型等免疫抑制性疾病混合感染[7]，降低了豬只的免疫應(yīng)答能力，當(dāng)天氣變化、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、生豬流動等外界不良因素影響時，條件性致病菌在體內(nèi)大量繁殖，從而引起感染導(dǎo)致死亡率升高。從本文的調(diào)查情況來看，2種以上細(xì)菌混合感染的生豬占48.8%，同類型的菌株藥敏特性存在差異，如果把各種細(xì)菌耐藥譜均考慮在內(nèi)，很可能無藥可用，且病毒感染情況，因未進(jìn)行檢測，尚不清楚。可見，保育豬疾病的防控比較復(fù)雜，在進(jìn)行疾病診斷時建議選擇發(fā)病早、中、晚期的小豬進(jìn)行實驗室檢測分析，查清原發(fā)、繼發(fā)病原以及繼發(fā)病原繼發(fā)的先后順序。以便為保育豬的預(yù)防、治療以及科學(xué)用藥提供有用的參考依據(jù)。