鮮切西蘭花貯藏過程中腐敗細菌的多樣性分析

程媛媛，古靜燕，陳宇航，岳鳳麗，安玉龍，秦淋淋

（1.山東農業工程學院食品科學與工程學院，山東省教育廳重點實驗室：特色農產品采后品控與綜合利用，山東濟南250100；2.濟南悟通生物科技有限公司，山東濟南250100）

西蘭花別名花椰菜，原產于地中海東部沿岸地區，其植株莖部頂端膨脹為綠色或紫色的花球，是主要的食用部分。因富含豐富的糖類、脂類、氨基酸、維生素和胡蘿卜素等，西蘭花營養成分居于同類蔬菜之首，被譽為“蔬菜皇冠”[1]。研究證明，西蘭花具有清化血管、解毒肝臟以及緩解耳鳴健忘、脾胃虛弱等病癥的功效[2]。然而因西蘭花花球圓正、緊密、品質優良，花蕾細小，花莖不空心，微生物易潛伏其中，從而造成西蘭花的腐敗，影響西蘭花的貯存。隨著人們生活節奏的日益加快和消費能力的增強，鮮切蔬菜產品行業得到了長足的發展，鮮切西蘭花也因營養全面而受到人們的歡迎。但鮮切蔬菜容易因鮮切造成組織損傷，細胞受損，汁液外流，極易腐爛變質，嚴重影響產品的銷售和質量安全[3]；而且鮮切蔬菜比一般蔬菜產品更容易滋生微生物，因此分離鑒定出其冷藏過程中與腐敗相關的微生物意義重大。

不同蔬菜上的優勢微生物群落千差萬別，如鮮切青椒上主要是歐文氏菌屬，芽孢桿菌和假單胞菌屬在鮮切生菜上屬于優勢菌種，這些微生物不僅能夠分解果膠，而且可以在低溫下存活并繁殖，最終引發鮮切蔬菜組織的腐敗[4,5]。目前，國內外關于鮮切西蘭花的研究主要涉及切割方式、貯藏溫度、保鮮劑、包裝方式等幾個方面[6-10]，對于其優勢腐敗微生物的研究較少。篩選、鑒定其中的優勢腐敗菌，研究其特性，為有針對性的殺菌處理提供理論基礎和技術支持，并對優化控制鮮切西蘭花的加工過程提供參考。本研究以市售綠鸚鵡西蘭花為材料，進行鮮切工藝處理，采用稀釋平板法分離腐敗的鮮切西蘭花樣品中的優勢菌株，依據細菌菌落特征，進行多次純化培養后得到純種菌，通過16S rDNA 序列分析進行菌種鑒定。然后選擇代表菌株進行唯一碳源培養實驗，以便分析西蘭花中污染細菌的多樣性以及可能致腐原因，為研究西蘭花的貯藏保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西蘭花品種為綠鸚鵡，2018 年4 月7 號采摘于云南昆明呈貢區菜園。經采摘、修剪后包裝（規格為5 kg），4℃預冷12 h，4 月9 號運至濟南匡山農產品交易市場，當天運送至山東農業工程學院食品科學與工程學院微生物實驗室，放于4 ℃冰箱備用。

1.2 試劑

平板計數瓊脂培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase，寶生物工程（大連）有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，北京全式金生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；果膠、木聚糖、甘露聚糖、殼聚糖、透明質酸、黃原膠等，北京索萊寶生物科技有限公司；硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、纖維素、羧甲基纖維素、微晶纖維素、淀粉等，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

DYCP-32DN 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GelDoc XR+凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；SHP-450 恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；Mastercycler nexus 梯度PCR 儀、5810R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；YSQ-50SII 高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 鮮切西蘭花樣品的制備

挑選新鮮西蘭花為試材，用鋒利的無菌刀具切分成直徑約為3～4 cm 的花球，以無菌水沖洗，瀝去多余的水分，裝入塑料小筐。置于4 ℃下貯藏備用。

1.4.2 菌落總數的測定

每隔2 d 取出冷藏的鮮切西蘭花樣品，一式3 份，分別在無菌操作條件下準確稱量25.0 g 西蘭花，充分研磨后加入到225 mL 0.85%滅菌生理鹽水中，振蕩混勻后可得到濃度為10%（w/V）的勻質研磨稀釋液，立即抽取1 mL 稀釋液進行梯度稀釋，參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2-2016）對菌落總數進行計數[11]。

1.4.3 優勢腐敗菌的分離與純化

取冷藏10 d 的鮮切西蘭花，按照1.4.2 的方法進行系列梯度稀釋，選擇3 個合適的稀釋度傾注平板，每個稀釋度重復3 次，置于36 ℃下培養48 h。待平板上生長出菌落后，挑選形態不同、存在生長優勢的單菌落，通過平板劃線法反復分離純化，鏡檢，得到單一菌株。將純化得到的優勢菌進行菌種保藏，置于-80 ℃凍存備用。

1.4.4 優勢腐敗菌的鑒定

（1）形態學觀察

菌落形態觀察：觀察不同菌落的大小、顏色、質地、形狀、邊緣結構以及表面形態等。

菌體形態觀察：挑取單一菌種進行16 h 的培養，制成標本，并在顯微視野下對細胞形態、排列方式等進行觀察。

（2）菌株的分子鑒定

模板DNA 的制備：在培養基中將上述挑取的優勢菌株進行活化培養，離心收集菌體。使用細菌基因組DNA提取試劑盒進行優勢菌全DNA 的抽提，測定濃度后放于-20 ℃保存備用。

PCR 擴增：采用通用引物序列27F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′）對菌株的16S rDNA 基因進行擴增。

PCR 反應體系（20 μL）：通用引物27F 和1492R 各1 μL（10 pmol/L），模板DNA（100 ng/μL）1 μL，dNTP Mix 10 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.1 μL，超純水6.9 μL。

PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保藏。

PCR 擴增產物檢測及測序：用膠回收試劑盒提取并純化PCR 擴增產物。取5 μL 純化產物，按照1:5 的比例與上樣緩沖液混合，然后進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳驗證后，連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，轉化到E.coli DH5α。通過氨芐抗生素進行抗性篩選，獲得陽性克隆。16S rDNA 基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，將得到的序列與GenBank 上的標準菌株16S rDNA 序列進行比對，選取同源性在98%以上的菌株構建系統發育樹。

（3）腐敗菌的唯一碳源培養

為配制多糖利用分析培養基，向離子培養基（硫酸銨4 g，氯化鈉1.25 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，雙蒸水1 000 mL，pH7.0）中分別添加10 種多糖底物至終濃度為0.1%（w/v），在115 ℃高壓下滅菌20 min 后，得到10 種唯一碳源培養基。

根據系統發育樹分析，其中兩大分支的代表菌種進行唯一碳源培養，36 ℃、200 rpm/min 培養3～5 d。分別用不含任何碳源的離子培養基，及含0.10%（w/V）葡萄糖的唯一碳源培養基進行對照組實驗，觀察菌體懸濁度，監測OD600，判斷菌株對多糖底物的利用能力，對代表菌株的降解特性進行初步鑒定。

1.4.5 數據處理及分析

實驗數據使用Microsoft Excel 2007 處理并作圖，采用SPSS 16.0 統計軟件進行LSD 分析。測序后的序列與GenBank 中收錄的標準菌株的16S rDNA 基因序列進行比對，應用MEGA 6.0 軟件中的Neighbour-Joining 法構建系統發育樹[12]。

2 結果與分析

2.1 鮮切西蘭花冷藏過程中菌落總數變化

分別對4 ℃冷藏0～12 d 的鮮切西蘭花樣品進行微生物菌落總數計數，結果如圖1 所示。微生物菌落計數結果表明，鮮切西蘭花的微生物菌落總數與西蘭花樣品的冷藏時間呈正相關性。冷藏前4 d，菌落總數增長緩慢；超過4 d 后，菌落總數開始出現指數性增長；在第10 d時可達到7.4×106CFU/g（新鮮樣品菌落總數為1.8×103CFU/g）；冷藏至12 d 后，菌落總數已達到5.5×107CFU/g。一般認為蔬菜初期腐敗時菌落總數約為106 CFU/g[13]，因此，可以認為本試驗的鮮切西蘭花樣品在冷藏第10 d 時開始腐敗。

圖1 鮮切西蘭花冷藏過程中菌落總數的變化Fig.1 Change in the total colony of fresh-cut broccoli during cold storage period

2.2 腐敗菌的分離及鑒定

2.2.1 菌株的形態學觀察

采用稀釋傾注平板法從冷藏10 d 的鮮切西蘭花樣品中分離腐敗菌，根據菌落形態特征及數目可將所有菌落大致分為8 組，分別編號P1～P8。腐敗菌的菌落及細胞形態特征如表1 所示。由于實驗中對優勢菌的分離及篩選主要依照其形態、質地、顏色等特征，因而不排除篩選出的菌株屬于同一種屬的可能性。

從表1 中可以看出，這8 株菌有6 株為桿菌，2 株為球菌，且兩株球菌菌落特征明顯不同，初步判斷為不同種屬的細菌。6 株桿菌綜合分析其菌落特征和個體形態，P2、P5，P6、P7 與P8 無明顯差別，可能為同屬的菌株，而P1 與其他5 株桿菌有較明顯的差別。

2.2.2 分子生物學鑒定

對篩選得到的8 株菌株提取其基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，樣品DNA 條帶清晰，大小符合要求，可作為PCR 模板。以1492R、27F 為引物，經PCR 擴增，得到穩定、清晰的條帶，片段大小約1 500 bp，說明8 株菌的16S rDNA 均被成功PCR 擴增出來（圖2）。

圖2 8 株腐敗菌16S rDNA 的PCR 擴增結果Fig.2 PCR amplification for 16S rDNA of 8 spoilagebacteria

圖3 顯示的是貯藏在4 ℃的鮮切西蘭花腐敗細菌的系統發育樹，由系統發育樹可知，P1 與高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）DSM 21631 親緣關系最近，相似性為99.59%；P2 與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）ATCC 12633 親緣關系最近，相似性為98.97%；P3 與小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）ATCC 51145 親緣關系最近，相似性為99.32%；P4 與木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）ATCC 29971 親緣關系最近，相似 性 為 99.79%；P5 與 克 雷 伯 氏 菌（Klebsiella pneumonia）ATCC 13884 親緣關系最近，相似性為100%；P6 與克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniae）DSM 28211 親緣關系最近，相似性為99.58%，P7 與沙雷氏菌（Serratia plymuthica）ATCC 183 親緣關系最近，相似性為99.45%；P8 與沙雷氏菌（Serratia glossinae）DSM 22080 親緣關系最近，相似性為99.79%。

表1 菌株的形態學特征Table 1 Morphological characteristics of strains

圖3 貯藏在4 ℃的鮮切西蘭花腐敗細菌的系統發育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree showing the relationship between sequences of dominant spoilage bacteri a of fresh-cut broccoli storage at 4 ℃

2.2.3 P2 與P3 的多糖利用能力分析

根據系統發育樹分析，8 菌株明顯分為兩大分支，第一分支包含惡臭假單孢菌P2、克雷伯氏菌P5 和P6 以及沙雷氏菌P7 和P8，第二分支包含高地芽孢桿菌P1、葡萄球菌P3 和P4。結合2.2.1 結果分析分別選取第一分支桿菌代表菌株P2、第二分支球菌代表菌株P3 分析其多糖利用能力，探索可能對鮮切西蘭花的致腐原因。結果如圖4 所示，在無碳源的陰性對照培養基中檢測不到菌株；菌株P2、P3 都能利用陸生高等植物來源的多糖，如微晶纖維素、羧甲基纖維素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉和果膠；菌株P2 還可以利用來源于甲殼動物的殼聚糖，而菌株P3 可以利用來源于微生物的黃原膠。綜合分析，兩株代表菌P2、P3 都可以在多種含植物多糖的唯一碳源培養基中生長，顯示出對植物多糖的顯著降解能力，這在一定程度上說明該類菌容易在鮮切西蘭花上滋生，其致腐能力較強。

圖4 P2、P3 菌株在唯一碳源培養基中生長的菌液濃度分析Fig.4 Analysis of the concentration of bacterias P2 and P3 growing in the sole carbon source medium

3 結論

對于鮮切果蔬來說，其表面微生物特別是腐敗菌數量的多少會直接影響產品的貨架壽命[14]。本試驗研究結果表明，鮮切西蘭花在冷藏過程中的優勢腐敗細菌主要為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、惡臭假單孢桿菌（Pseudomonas putida）、葡萄球菌（Staphylococcus spp.）、克雷伯氏菌（Klebsiella spp.）、沙雷氏菌（Serratia spp.）。其中，5 株細菌為革蘭氏陰性菌，這可能與貯藏條件有關，革蘭氏陽性菌的最適生長溫度為20～30 ℃，而革蘭氏陰性菌則可在較低溫度下生長繁殖[15]。大量研究結果顯示，惡臭假單胞菌是果蔬低溫冷藏下的優勢腐敗菌，這可能與蔬菜組織含酸量低，易遭受土壤微生物如假單胞菌、歐文氏菌等的侵染有關[16]。

另外，按照菌體形態隨機選擇系統發育樹上兩大分支的代表菌株P2 和P3，進行了唯一碳源培養實驗，發現兩株代表菌P2、P3 都可以在多種含植物多糖的唯一碳源培養基中生長，顯示出對植物多糖的顯著降解能力，這在一定程度上說明該類菌容易在鮮切西蘭花上滋生，其致腐能力較強。

綜上，這一結果為鮮切西蘭花冷藏過程中的微生物腐敗進程和機制提供了生物學證據。后期在研究鮮切西蘭花產品保鮮策略時，可針對優勢腐敗菌采取抑菌措施；同時，這些腐敗微生物也可以作為鮮切西蘭花產品質量安全系統評價的潛在指標。