槲皮素在Caco-2單層細胞模型上的跨膜吸收和甲基化代謝

李素云，李 崢，王立芹，高蔚娜，張振清，郭長江

（1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038；2.軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學和作業醫學研究所，天津300050；3.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，北京100850；4.河北醫科大學公共衛生學院流行病學與統計教研室，河北石家莊050011）

槲皮素（quercetin）及其糖苷衍生物是膳食成分中最常見的類黃酮之一，廣泛存在于包括蔬菜、水果和中草藥等植物中，在機體內能產生多種有益的作用[1-2]。已有較多的研究報道，槲皮素是類黃酮家族中最有力的抗氧化劑之一，特別是清除高活性自由基，如清除過氧化亞硝酸和羥基的能力。另外，體外實驗表明，其具有抗凝血、抗肝纖維化、抗菌、抗動脈粥樣硬化和抗增殖等作用[3]。槲皮素可直接調節某些生物轉化酶的基因表達，通過與雌激素結合位點結合抑制細胞增殖[4-5]。近年來一些研究表明，槲皮素在腸道中可非競爭性地抑制葡萄糖和果糖的易化擴散，具有調節糖的腸道吸收、預防肥胖和控制血糖的作用[6]，同時具有刺激實驗動物胰島素分泌、改善胰島素敏感性和胰島素抵抗狀態、促進外周組織對葡萄糖利用、抑制氧化應激反應、下調炎癥因子基因表達等作用[7-8]。由于槲皮素在自然界廣泛的分布和多樣的生物學作用，其在疾病預防和治療中的潛力開始被關注，近年來成為諸多領域的研究熱點。

但是，槲皮素在體外條件下極不穩定，見光易分解、氧化。同時大量體內和體外實驗表明，槲皮素在腸黏膜細胞中即發生廣泛的代謝轉化，門靜脈中幾乎檢測不到槲皮素原型，循環中的槲皮素苷元含量甚微[8-9]。因此，有關其在腸道內的吸收規律及可能的影響因素仍無定論[10-11]，而口服生物利用度低一直被認為是其作為功能性食品使用的主要障礙[13]，這成為限制深入了解和有效利用槲皮素的瓶頸之一。本研究利用小腸吸收模型Caco-2細胞單層和外排蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥蛋白2（multi-drug resistance protein 2，MRP2)的特效抑制劑環胞菌素A（cyclosporin，CysA）和MK571，對槲皮素的跨膜轉運進行了動態考察和分析，為進一步揭示槲皮素在腸道的吸收過程及可能的影響因素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

Caco-2細胞，40～50代，美國模式培養物集存庫。槲皮素、檉柳黃素（tamarixetin）、異鼠李亭（isorhamnetin）、L-谷氨酰胺和胰蛋白酶，美國Sigma 公司；甲醇（色譜純），美國Fisher 公司；DMEM 培養基，美國Gibico公司；胎牛血清和非必需氨基酸，美國Hyclone 公司；丁螺環酮（批號0803021），北京華素制藥股份有限公司；其他試劑均為分析純。Millicell 12 孔板，美國Millipore 公司；高效液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）（Agilent 1100 LC/MS DVL，DE），美國Agilent公司。

1.2 細胞培養

Caco-2 細胞用DMEM 培養基（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液）培養，孵育條件為37℃，5%CO2。

1.3 槲皮素跨膜轉運實驗[3]

實驗前，將接種有細胞的12 孔Millicell 板以37℃PBS（pH 7.2）浸泡15 min，輕微沖洗Millicell板，除去細胞表面附著物。

腔側→基底側的跨膜轉運：在腔側加入含槲皮素的PBS 600 μL，槲皮素終濃度為9.0或18.0 mg·L-1；基底側加入PBS（pH 7.2）1200 μL；每濃度設3復孔，置37℃，5%CO2條件下孵育，分別于30，60，90，120 和150 min 于基底側和腔側分別取樣50 μL，-4℃冷藏備用，并各補充等體積PBS。空白對照組腔側和基底側均只加PBS，其他操作相同。取出的樣品精確加入等體積內標溶液后充分混勻，進樣20 μL，應用LC-MS 測定槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素。

基底側→腔側的跨膜轉運：將含槲皮素的PBS 1200 μL 加入基底側，槲皮素終濃度為9.0 或18.0 mg·L-1；腔側加入PBS600 μL；其他操作同上。

P-gp和MRP2抑制實驗：先于腔側加入300 μL CysA 10 mmol·L-1或MK571 1 mmol·L-1（pH=7.2），孵育15 min 后，再加入300 μL含槲皮素的PBS 溶液，終濃度為9.0和18.0 mg·L-1，其余操作同上。

1.4 槲皮素及其甲基代謝產物的LC-MS檢測[4]

液相條件：色譜柱為Agient-C18 柱，2.1 mm×100 mm，3.5 μm，柱溫為室溫，流動相A為水（含0.1%甲酸）；流動相B為甲醇+乙腈（含0.1%甲酸），A∶B=65∶35（V/V）。流速：0.2 mL·min-1；進樣量：20 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源，霧化氣壓力30 psi，干燥氣流速8 L·min-1，干燥氣溫度35℃，毛細管壓力3000 V，四極桿溫度保持在99℃，增益為1，峰寬為0.10 min，選擇正離子模式，采用選擇離子監測（SIM）測定以提高靈敏度。

應用流動注射方式（FIA）、以全掃描模式優化各化合物的Fragmentor 值及分子離子峰的質荷比（m/z）。槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的m/z 分別為303，317和317，內標丁螺環酮m/z為386.2。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 槲皮素雙向轉運中槲皮素及其甲基化代謝產物在加載側和透過側含量的動態變化

2.1.1 槲皮素含量的動態變化

由圖1可見，槲皮素9.0和18.0 mg·L-1在Caco-2單層細胞模型上雙向的跨膜轉運過程中，透過側槲皮素的動態變化均呈先升后降的趨勢，120 min 達峰值，隨后下降（P＜0.01）；加載側剩余量在150 min內呈持續下降趨勢（P＜0.01）。

2.1.2 異鼠李亭含量的動態變化

由圖2可見，在Caco-2單層細胞模型上雙向跨膜轉運過程中，槲皮素9.0和18.0 mg·L-1組不同時間點，于加載側和透過側均能檢測到異鼠李亭，其雙側含量呈現與母體化合物槲皮素相似的趨勢特征，120 min 達峰，150 min 下降，且18 mg·L-1組異鼠李亭的含量均高于同側的9 mg·L-1組。另外發現，兩側異鼠李亭的含量在雙向轉運之間有差別：腔側→基底側轉運中，從30～150 min 腔側的含量始終高于基底側（P＜0.01）；而基底側→腔側轉運中，30 min 時基底側的含量高于腔側，60 min 后腔側含量高于基底側，直至150 min孵育終點。

Fig.1 Dynamic changes of quercetin amount on receiver side（A1 and B1）and loading side（A2 and B2）during bidirectional transport. A：apical→basolateral transport；B：basolateral→apical transport. s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time

2.1.3 檉柳黃素含量的動態變化

由圖3可見，槲皮素在Caco-2單層細胞在雙向跨膜轉運過程中，9.0和18.0 mg·L-1組不同時間點，于加載側和透過側均能檢測到檉柳黃素。雙側檉柳黃素的含量變化和分布趨勢與異鼠李亭相似，18 mg·L-1組檉柳黃素的含量均高于同側的9 mg·L-1組（P＜0.01）。檉柳黃素在兩側的分布特點亦與異鼠李亭相似，在腔側→基底側轉運中，腔側的含量始終高于基底側（P＜0.01）；基底側→腔側轉運中，30～60 min時基底側的含量高于腔側，60 min后腔側含量高于基底側（P＜0.01），直至150 min孵育終點。

Fig.2 Dynamic changes of isorhamnetin on both sides after bi-directional transport of quercetin. A1 and B1：apical side→basolateral side；A2 and B2：basolateral side→apical side；A：quercetin 18 mg·L-1；B：quercetin 9 mg·L-1.s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time.

2.2 槲皮素雙向轉運中槲皮素及其甲基化代謝產物在加載側和透過側相對含量的分析比較

由表1 和表2 可見，在30～150 min 孵育時間內，透過側槲皮素在120 min達到峰值時，仍不及加載量的7%～10%，150 min 時減至6%～7%；而加載側剩余量在30 min 時已不足加載量20%～25%，且隨孵育時間持續減少，150 min 時不足加載量的10%，表明在跨膜轉運過程中，加載側減少的槲皮素＞90%未檢測到。槲皮素的甲基化代謝產物異鼠李亭和檉柳黃素在兩側的檢出量亦僅為槲皮素加載量的0.1%～0.3%。

Fig.3 Dynamic changes of tamarixetin on both side after bi-directional transport of quercetin. A1 and B1：apical side→basolateral side；A2 and B2：basolateral side→apical side；A：quercetin 18 mg·L-1；B：quercetin 9 mg·L-1. s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time.

Tab.1 Dynamic changes of percentage of quercetin and methyl quercetin on both sides after apical side→basolateral side transport of quercetin 18 mg·L-1loaded

Tab.2 Dynamic changes of percentage of quercetin and methyl quercetin on both sides after basolateral side→apical side transport of quercetin 18 mg·L-1 loaded

2.3 P-糖蛋白和MRP2 對槲皮素跨膜轉運的影響

由圖4可知，槲皮素在Caco-2單層細胞腔側→基底側跨膜轉運過程中，在槲皮素、CysA+槲皮素和MK571+槲皮素孵育條件下，槲皮素9.0和18.0 mg·L-1透過側槲皮素含量的動態變化均呈現隨孵育時間先升后降的趨勢，120 min達峰，隨后下降（P＜0.01）。與槲皮素組比較，CysA+槲皮素和MK571+槲皮素組透過側槲皮素均顯著高于槲皮素組（P＜0.01）。

Fig.4 Dynamic changes of quercetin amount on basolateral side during transmembrane transport of apical side→basolateral side.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time.

3 討論

腸道吸收和排泄是決定口服黃酮類化合物生物利用度的兩個主要因素，不良的口服生物利用度已被認為是其作為藥物和營養劑使用的一個主要障礙[14-15]。已往研究發現，槲皮素口服后，血液中幾乎檢測不到槲皮素原型的存在，由于槲皮素分子量大、極性強，因此在很長一段時間內被認為很難在腸道吸收，口服后的吸收可以忽略不計[16-18]。近年來的大量研究證實，槲皮素可以在小腸各段被吸收，并且在腸道黏膜細胞內即發生廣泛的代謝[17-18]。Walgren等[19]采用Caco-2細胞研究發現，槲皮素可通過結腸上皮細胞吸收。Hollman等[20]通過回腸造口術的志愿者口服槲皮素，發現實際上人的腸道可吸收相當量的槲皮素，但在吸收過程中首過代謝嚴重，因此口服給藥槲皮素后原型成分的血漿濃度水平極低，其中被吸收的槲皮素僅有不到1.5%以原型通過尿液排出。本課題組前期研究也表明，槲皮素在Caco-2單層細胞模型上，可以完整的分子形式被Caco-2 細胞攝取并分泌到基底側[21]，同時還檢測到槲皮素的甲基化代謝產物。槲皮素在Caco-2 細胞上的跨膜轉運特征與其糖苷不同，槲皮素在跨膜轉運過程中隨孵育時間呈現先升后降的動態特征，而其糖苷則呈現出隨孵育時間持續升高的動態表現，150 min 孵育時間內沒有觀察到平臺期，透過側的甲基代謝產物具有和其原型化合物相似的動態表現[22-23]。對槲皮素的穩定性考察表明，在37℃，5%CO2細胞孵育條件下，180 min時間內槲皮素的穩定性好[24]，從而可以排除槲皮素在細胞實驗中的穩定性不佳對其動態特征產生的影響。由此推測，槲皮素獨特的動態特征可能與其跨膜轉運過程中的代謝有關，同時也不能排除外排蛋白對其跨膜吸收的影響[25-26]。但即便如此，仍有研究認為槲皮素作為膳食和中草藥中普遍存在的黃酮類物質，生物利用度較差，且不同的研究結果差異也較大[27]。

本研究結果表明，在Caco-2 單層細胞模型上的雙向轉運過程中，當加載側槲皮素呈現隨孵育時間持續下降的趨勢時，透過側測到的槲皮素呈現出先升后降的特征表現，120 min 達峰，隨后下降，但120 min 達峰時，透過側槲皮素的量也才相當于加載量的7%～10%。而加載側槲皮素在孵育30 min時即已剩余不足加載量的20%～25%，150 min時僅為加載量的約10%。即加載側減少的槲皮素與透過側測定到的槲皮素之間相差懸殊，在跨膜轉運過程中，加載側減少的槲皮素的近90%未在透過側檢測到。槲皮素的甲基化產物異鼠李亭和檉柳黃素在兩側的量也僅為相對于槲皮素加載量的0.1%～0.3%。由此表明，在150 min 時間內，加載量的約90%已經被吸收，而透過側檢測到的量卻不足加載量的10%，二者相差在10倍左右。

進一步對槲皮素甲基代謝產物進行分析，顯示槲皮素在雙向轉運過程中，150 min時間內，加載側和透過側均能測定到異鼠李亭和檉柳黃素，且在兩側的動態分布均呈現出與透過側母體化合物槲皮素相似的動態特征，即在孵育的前120 min 內呈逐漸升高的動態變化趨勢，120 min 達峰，隨后下降。研究還發現，在由腔側→基底轉運過程中，異鼠李亭和檉柳黃素在任一時間點腔側的含量均顯著高于基底側；而在基底側→腔側轉運中，30 min時基底側異鼠李亭和檉柳黃素的量高于腔側，60～90 min 時腔側面的含量超過基底側，且這一趨勢一直持續到150 min 孵育終點。也就是說，無論腔側還是基底側加載槲皮素，30～60 min 后腔側的甲基槲皮素的量總是高于基底側，其原因待深入研究。

本研究同時觀察了P-pg 和MRP2 對槲皮素跨膜轉運的影響。結果發現，P-gp 特效抑制劑CysA和MRP2 特效抑制劑MK571 均顯著增加了槲皮素的透過量，提示P-gp和MRP2對槲皮素跨膜轉運可能具有一定的影響。

綜上所述，槲皮素在跨膜轉運過程中的代謝轉化有可能是影響其吸收和生物利用度的影響因素之一，外排蛋白P-pg和MRP2對其跨膜轉運亦有一定的影響。在此基礎上，深入研究槲皮素在腸道吸收過程中的代謝轉化，以及這些代謝轉化對槲皮素生物活性及跨膜吸收產生的影響具有重要意義。