白細胞介素4和白細胞介素13與M2型肺泡巨噬細胞在肺纖維化中的作用研究進展

尹健彬，皮 娜，張 旋

（昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明650500）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種治愈難度很大而且死亡率高的慢性間充質性肺病，其經多種刺激因子刺激而引起肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞增殖、成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化和膠原的形成并引起病理性的細胞外基質沉積，以及由于瘢痕的形成而致使肺結構發生進行性和不可逆性的破壞[1]，導致氣體交換受阻、肺功能急劇下降、呼吸困難等器官功能障礙[2]，最終發展成為因呼吸衰竭而危及生命的纖維化間充質性肺病。雖然近些年對PF 治療的研究有了長足的發展，但是對于PF發病機制的認識到目前仍不清楚，然而研究者們普遍認為，在這種疾病發生發展的許多形式中通常伴有炎癥和免疫反應的過程[3]，其中不乏包括肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage，AM）參與的炎癥反應和2 型輔助性T 細胞（type-2 helper T cell，Th2）參與的免疫反應。

白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）和IL-13 主要是由CD4+T 細胞極化的Th2 細胞亞群分泌的炎性細胞因子[4]。有研究報道，IL-4和IL-13參與支氣管哮喘的發生過程，是引起氣道高反應性和持續炎癥的始作俑者[5]；對特發性PF 的臨床研究發現，患者肺組織中的Th2 相關細胞因子分泌明顯增多[6]，在PF 動物模型上的研究更是體現出IL-4 和IL-13含量與PF存在正相關關系[7]；骨髓來源并存在于外周血或周圍組織中的單核細胞，是宿主防御和應對有害刺激的先天性免疫細胞，而AM 是肺內衍生的常駐細胞，具有吞噬和抗原提呈功能，能夠防御外來病毒和微生物入侵，是肺內的第一道天然防線[8]；當受到刺激時，這些新募集來的單核細胞和常駐AM在肺組織微環境中被遇到的介質激活，分化為促炎性的經典激活巨噬細胞（classically activated macrophages，M1）和抗炎性替代激活巨噬細胞（alternatively activated macrophages，M2）亞群。研究顯示，在PF形成過程中，M2型巨噬細胞發揮著重要的作用[9]。為闡明這一關系，本文以近年來發表的國內外文獻為依據，對IL-4和IL-13與M2型巨噬細胞在PF過程中的相互作用及影響進行綜述。

1 Th2 相關細胞因子IL-4 和IL-13 與肺纖維化

機體的免疫應答有自限性內在調節的功能，從而避免自身過度免疫應答引起的損傷，以保證機體自身內環境的穩態，而其調節功能的發揮有賴于T細胞的參與[10]。研究發現，在外源性或自身免疫紊亂刺激下，使得機體自身異常的免疫反應貫徹于肺部炎癥的啟動、發展以及PF的整個過程，這讓研究者們越來越認識到肺組織中的T細胞亞群及其分泌的細胞因子在維持免疫平衡中的重要性；免疫功能異常在肺部引起的炎癥及其后續產生的纖維化，不得不讓人們的目光從細胞水平轉向炎性因子介導的分子水平。

在經不同抗原刺激后，CD4+T細胞可分化為表達不同細胞因子的效應細胞群即Th1和Th2細胞亞群，因其分泌不同的細胞因子而介導不同的免疫應答類型即Th1型和Th2型細胞因子反應[11]，有研究認為二者之間存在著相互拮抗作用，1 型反應分泌的細胞因子在介導細胞免疫的同時拮抗2型反應的發展[12]，而2 型反應又反過來抑制1 型反應和1 型反應驅動的炎癥[13]，從而保證2 個細胞亞群平衡和適度的免疫應答。Th2 細胞群主要分泌IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13等細胞因子[11]，以其為主介導的2 型免疫對機體既有保護作用[13]又有致病活性[14]，Th2細胞因子的過度產生是許多過敏性和纖維化疾病發生發展的主要機制。自1995 年Wallace 等首次提出PF中存在“Th2優勢”學說以來，不斷有研究證實了這一觀點。最新的報道稱，碳納米管誘導的PF其機制主要就是激活了Th2細胞以及誘導產生了Th2細胞因子（即Th2 優勢），特別是IL-4 和IL-13[15]。Mojiri-Forushani等[16]的研究顯示，纈沙坦對PF具有顯著的保護作用，這種效應的有效途徑是通過抑制博來霉素誘導的Th2細胞因子IL-4的產生來實現。

大量研究顯示，纖維化的發生與Th2 型細胞因子的發展密切相關[17]，其主要以IL-4 和IL-13 介導巨噬細胞的激活、成纖維細胞的增生和分化、ECM的沉積等最終導致PF 的形成（圖1）。存在于AM和成纖維細胞等細胞膜表面的IL-4α 受體亞型（alpha subunit of IL-4 receptor，IL-4Rα）/IL-13Rα直接誘導著纖維化激活過程中的次級反應[17]，而且證實這些受體驅動了IL-4 和IL-13 的信號傳導，并增加巨噬細胞和成纖維細胞的遷移和侵襲性[17-18]。Zhang等[19]研究發現，CpG-寡脫氧核苷酸可以防止PF 的形成，進一步分析顯示，其可能的機制是限制了Th2相關細胞因子（IL-4和IL-13）的表達，同時使Th1 相關細胞因子（IFN-γ 和IL-12）表達增加，巨噬細胞聚集減少等。更令人振奮的是，有直接的研究結果證明，當下調Th2 相關細胞因子時，可以阻止PF的進程[20]。

2 M2型肺泡巨噬細胞的抗炎和促纖維化作用

圖1 T輔助性細胞及其亞群在肺纖維化中的作用.

巨噬細胞作為機體固有免疫的重要組成部分，參與包括炎癥、免疫反應和纖維化在內的多種疾病的發生發展過程。根據巨噬細胞活化的二分法，巨噬細胞可分為M1 和M2，M1 主要由Th1 型細胞因子IFN-γ激活，主要參與Th1型免疫反應，其通過合成標志性因子誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）促進炎癥反應；M2則由IL-4和IL-13 激活，從而上調1 型精氨酸酶（arginase type 1，Arg-1）、Fizzl、YM-1（幾丁質酶家族成員）和甘 露 糖 受 體（mannose receptor，MR）等 標 志物[21-22]。有研究顯示，在PF進程中，M1和M2之間存在相互拮抗性的平衡，即M1 以促炎和細胞毒性為主，M2 則以抗炎和促纖維化為主。值得注意的是，肺組織在由急性炎性損傷向慢性PF 轉變過程也伴隨著M1 向M2 的轉變，并最終以M2 為主[23]。目前多數學者普遍認為，M1和M2的本質區別在于它們分泌的標記分子iNOS 和Arg-1 對底物L-精氨酸競爭代謝的問題，iNOS催化精氨酸生成NO和瓜氨酸，而Arg-1與精氨酸結合生成尿素和鳥氨酸；鳥嘌呤是膠原蛋白的前體，從而有利于膠原的形成及最終導致PF[24]。

有研究認為，炎性單核細胞衍生的M1是促M2的主要來源[25]，然而這種前體關系的直接證據是有限的。當然更多的證據則認為肺中M2主要是來源于AM，當用平陽霉素（博來霉素）處理AM 缺陷的CSF-1 敲除小鼠時，表現出M2 的聚集減少[26]。即使這樣，單核細胞和組織衍生的M2 還是能被有效地區分出來。研究顯示[27]，2 種來源的M2 都表達Arg1，Ym-1 和Fizz-1，但只有單核細胞衍生的M2表達PD-L2，Raldh2，CD206 和CX3CR1，這就為M2 來源的進一步探討提供了有力的支撐。另外，在人和嚙齒動物的纖維化發生過程中，積聚在肺部的M2已被確定為許多關鍵的促纖維化介質，如轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β），結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和趨化因子配體18（chemokine ligand-18，CCL-18）的主要來源，M2也被認為通過釋放TNF-α，IL-1，IL-10，IL-13，IL-33，PDGF，FGF和纖維連接蛋白促進纖維化，這些在PF 患者和纖維化肺病的動物模型中都有體現[28]。

3 IL-4 和IL-13 受體可能是治療肺纖維化的有效途徑

替代激活的巨噬細胞M2其激活通路存在多種途徑，但本文主要闡述由IL-4 和IL-13 刺激并與其受體IL-4Rα 和（或）IL-13Rα 結合，從而發揮的作用。研究認為，IL-4Rα 和（或）IL-13Rα 以3 種不同的形式存在[29]：①IL-4Rα1與γ鏈（γc）結合形成的受體，主要與IL-4 識別；②IL-4Rα1 與IL-13Rα1 結合形成的受體，主要與IL-4或IL-13識別；在IL-4缺失的小鼠中并未顯現出阻止了輻射小鼠中的替代巨噬細胞活化和纖維化[30]，其可能原因是IL-4和IL-13存在共享/復合受體組分[16]，從而使IL-4介導的效應以其他相類似的作用途徑介導，以補償方式刺激纖維化過程；③IL-13Rα2鏈受體，其與IL-13識別，但是目前IL-13Rα2 鏈受體的信號轉導還存在爭議。參與激活M2 的通路較多，主要包括NF-κB、c-Maf/信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）、c-MYC/STAT/過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor-γ，PPAR-γ）[31]、干擾素調節因子（interferon regulatory factors，IRF）/STAT[32]、JAK/STAT 信號途徑[33]，但在PF及IL-4R和IL-13R分布的背景下，后3 者是有效的M2 激活途徑（圖2）。以Janus 激酶（Janus kinase/JAK/STAT）信號途徑為例，IL-4 和IL-13 與其受體結合并激活JAK（JAK1和JAK3/JAK2），激活的JAK一方面募集胰島素受體底物家族（insulin receptor substrates，IRS）與其形成復合物，進一步激活銜接蛋白生長因子受體結合蛋2（growth factor receptor bound-2，GRB-2）和磷脂酰肌醇3-激酶，從而募集STAT6 磷酸化；另一方面JAK可直接引起STAT6的磷酸化和易位；磷酸化后的STAT6 可與PPAR-γ 和Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor-4，KLF-4）結合使M2極化[21]，最終產生Arg-1，而Arg-1 是形成M2 的標志[22]。可見，在PF 形成的IL-4和IL-13刺激通路中其受體扮演著至關重要的作用，有研究顯示用IL-4刺激缺乏IL-4R的巨噬細胞群，其組織纖維化程度明顯減少，預示著阻斷IL-4R 和IL-13R 受體可能是治療PF的有效途徑[16，21]。

4 IL-4 和IL-13 激活的M2 型巨噬細胞對肺纖維化的雙重作用

肺中存在多個巨噬細胞群，因其高度可塑性的特點而發揮不同的功能，盡管大多數研究認為IL-4和IL-13激活的M2型肺泡巨噬細胞和PF存在直接關系，但是還是有學者對此存在爭議。

圖2 M2巨噬細胞的激活通路.

一方面有研究者認為，M2 型肺泡巨噬細胞可以促進PF的發展[9]。在一定程度上，IL-4/IL-13在肺組織中的含量是評價是否為PF 的指標之一，和正常肺組織相比，PF患者肺組織的IL-13水平更高，研究者從纖維化組織中分離的巨噬細胞經培養產生的IL-13 確實比正常肺組織中的更高[34]；雖然目前還沒有找到M2 型肺泡巨噬細胞與PF 之間存在直接關系的證據，但是研究者們巧妙的通過檢測M2的標記因子在PF中的變化來間接反映M2與PF的聯系。有研究發現，來自于特發性PF患者肺組織中的巨噬細胞表達的Arg-1比正常肺組織中的要高[35]，也有研究提出，在用Th2細胞因子IL-4和IL-13刺激后“替代激活”的細胞誘導的激酶引起多胺和脯氨酸的合成增多，進而在細胞增殖，膠原沉積和組織修復中起作用[36]；Zhu 等[9]的研究結果表明，M2 通過TGF-β/ Smad2 信號轉導途徑誘導上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并同時采用IL-4 體外誘導RAW264.7 形成M2，經過培養后檢測細胞上清中的TGF-β，發現TGF-β含量增加；由此可見，M2 型肺泡巨噬細胞伴隨著PF 發生發展的整個過程，似乎起著促纖維化的作用。

另一方面，一些研究者認為，M2型AM僅僅只是纖維化的結果，并不是病因；它的存在只是作為具有吞噬作用的炎癥細胞來清除多余的ECM，也就是說有一定的抗纖維化作用。在矽肺背景下，Carneiro等[37]在Th1 型小鼠C57BL/6 上研究了博舒替尼的抗PF作用，發現博舒替尼能夠減少M1并增加矽肺小鼠肺實質和肉芽腫組織中的M2 數量，從而減少其組織中的ECM含量，同時M2以其高內吞的清除能力發揮抗炎作用，使Arg-1，MR和YM-3的表達增加；但Misson等[38]的研究顯示，纖維化反應的早期M2相關基因如Arg-1 mRNA的上調與PF的嚴重程度并沒有相關性，Arg-1 mRNA不具有纖維化肺反應的特異性，然而MR卻似乎可以促進ECM的攝取[39]，最終表現出M2的抗纖維化作用。

無論是促進纖維化的進程還是抗纖維化，M2在某一個方向分泌的相關因子的“量”，實際影響著M2 對肺的病理性進程；某一些因子可能直接促成PF，而另一些因子可能存在“量效關系”，適當量時起著抗炎、組織修復的作用，但一旦過表達就成了促纖維化因子，而這些改變都取決于損傷/刺激的持續時間。有研究者發現，M2可有抗炎和促進傷口愈合的表型，但當這一過程失調時，這些反應的過度激活就可致纖維化的發展[21，40]；已知經IL-4和IL-13激活的M2分泌IL-10，其是具有促纖維化作用的經典抗炎細胞因子。有研究顯示，IL-10在肺部有抗炎作用[21]，其可以改變平陽霉素誘導的炎癥反應，從而減緩纖維化的發展[41]；然而，發現當IL-10過表達時，就會成為促纖維化因子[42]。因此，經IL-4和IL-13激活的M2 型肺泡巨噬細胞對PF 的作用具體是促進還是拮抗，還需深入研究。

5 展望

無論是M1 或M2，或是M2 分泌的各種相關細胞因子，機體發生PF 必然是肺組織受到了持續的刺激，并分泌產生了高于正常肺組織的Th2相關細胞因子，從而決定了單核巨噬細胞向M2分化，并最終走向PF這條道路，只是PF的程度受刺激程度的影響。同時，有研究顯示，自噬可以誘導巨噬細胞向抗炎方向M2 極化，由此筆者考慮由其他途徑激活的M2 與由IL-4 和IL-13 活化的M2 的功能在PF中的作用是否存在本質區別，即不同途徑的M2 是否是兩個有區別的概念，還需要進一步查閱相關參考文獻查證。然而，不容忽視的是，Th2相關細胞因子在PF過程中的作用，如何阻斷IL-4和IL-13對巨噬細胞的激活作用從而治療PF，將是抗PF 藥物研究的一個重要突破口。

隨著高通量測序、基因組芯片以及基因敲除技術等分子生物學的發展和廣泛應用，未來通過基因水平控制和篩查，對于IL-4和IL-13與M2型肺泡巨噬細胞的相互作用以及其與PF的作用關系將會越來越明晰，而這些細胞和關鍵因子也可能會成為潛在的治療靶點并為抗PF活性化合物的篩選提供一個新的通路。