對乙酰氨基酚對斑馬魚胚胎甲狀腺激素相關基因表達的影響

康桂英，董 武，楊景峰，楊曉野

（1.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特010018；2.內蒙古民族大學動物科學技術學院，內蒙古自治區毒物監控及毒理學重點實驗室，內蒙古 通遼028000）

對 乙 酰 氨 基 酚（N-acetyl-p-aminophenol，APAP）是一種臨床上廣泛使用的解熱鎮痛藥物，主要被用于感冒發熱和緩解疼痛。來自美國的統計數據顯示，APAP 成為急性肝功能衰竭的主要因素[1-2]，約50%的急性肝功能衰竭是由于超劑量使用APAP引起[3-4]。近些年，越來越多的流行病學研究表明，APAP 可能引起流產、早產、胎兒畸形和男性不育，并且影響神經發育，引起行為障礙[5-7]。研究發現，以上現象可能與APAP 破壞甲狀腺激素的合成相關，被認為是一種新問題[8-10]。

體內甲狀腺激素主要包含四碘甲狀腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）和三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）。甲狀腺激素的合成，先是碘化物在甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）的作用下被氧化成活性碘，活性碘與甲狀腺球蛋白上的酪氨酸殘基結合生成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸。然后2個分子的二碘酪氨偶聯生成T4；1個分子的一碘酪氨酸與1個分子的二碘酪氨發生偶聯，形成T3，通常T4與T3之比為20∶1。T4通過二型脫碘酶（deiodinase type 2，DIO2）轉換成具有極強生物活性的T3。T3在體內的含量及動態平衡對機體的生長、代謝具有非常重要的影響。而T3的轉化滅活是由三型脫碘酶（deiodinase type 3，DIO3）來完成的，即轉化成二碘甲狀腺原氨酸（diiodothyronine，T2）作用失活而達到調節的目的[11-13]。T3 或T4 均有2 種存在形式，一種是與甲狀腺結合球蛋白結合，稱之為結合型；另一種呈游離狀態，為游離型，這兩者可以相互轉化。T3進入細胞核后與甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，THR）結合而發生特定生理作用。斑馬魚有2種甲狀腺激素受體亞型，一種是α 受體亞型（thyroid hormone receptor alpha，THRα），一種是β 受體亞型（thyroid hormone receptor beta，THRβ）。甲狀腺素（thyroid hormone，TH）在有機體生長發育中起到其重要的調節作用，甲狀腺素的不足將會造成胚胎發育遲緩，在人表現為呆小癥。

酪氨酸和酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）與甲狀腺素合成密切相關，同時也參與黑色素合成。TYR催化L-酪氨酸羥基化轉變為3，4-二羥基苯丙氨酸（3，4-dihydroxyphenyl L-Alanine，DOPA）和多巴醌（dopaquinone，DQ），DQ 經過一系列轉變后，形成黑色素[14]。1-苯基-2硫脲（1-phenyl 2-thiourea，PTU）是甲亢治療藥物，抑制甲狀腺細胞內的過氧化酶系統，抑制甲狀腺素的合成，在斑馬魚實驗中也經常使用PTU 抑制黑色素而便于觀察[15]。McMenamin 等[16]以斑馬魚為模型，探討了斑馬魚甲狀腺素對不同色素的發育以及調控起到非常關鍵的作用。斑馬魚作為疾病模型動物，具有對藥物的敏感性、發育迅速、初期透明而容易觀察和操作，繁育簡單而費用低廉，特別是轉基因斑馬魚的廣泛應用為實驗帶來更多的便利，近年來使用斑馬魚進行藥物的篩選以及毒性機制研究，有了長足的發展[17]。

本研究以斑馬魚為實驗動物，以APAP 為受試藥物，觀察了斑馬魚眼部色素的變化情況，同時測定了總T3（total T3，TT3）或總T4（total T4，TT4）的含量，檢測了TPO、Thrβ、Dio2、Dio3、Thrα和促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin-releasing hormone，Trh）等與甲狀腺激素相關基因的表達情況，探討APAP對斑馬魚甲狀腺激素表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和主要儀器

實驗所用斑馬魚為野生型AB 品系，由日本酪農學園大學贈送，在本實驗室培育和繁殖。APAP（Sigma，美國），溶于0.1%二甲亞砜中備用。魚類甲狀腺素ELISA 檢測試劑盒（上海信裕生物科技公司，中國）；反轉錄試劑盒（Promega，美國）；SYBR Green I PCR 反應混合液（大連，TaKaRa公司）；引物（上海生物工程有限公司合成），引物序列見表1。

Multiskan FC 型酶標儀（Thermo 公司，美國），5415R 型臺式離心機（Eppendorf 公司，德國），DXM1200 數碼照相機、E600 倒置顯微鏡及EclipseNet 圖像分析軟件（Nikon 公司，日本）。

1.2 動物分組和染毒

雌雄斑馬魚按1∶1 的比例放置在缸內，由隔板分開，次日清晨，取下隔板，待斑馬魚產卵后收集，將收集到的卵用斑馬魚培養液洗干凈，在顯微鏡下挑選受精后4 h（four hours post fertilization，4 hpf）且發育一致的卵，移入6 孔板中，每孔10 枚。實驗分4 組，分別為正常對照組、APAP 2，4 和8 mmol·L-1組，每個組設3 復孔，隨后于光照培養箱中恒溫28℃孵育，連續給藥4 d，分別在24，48，72和96 hpf觀察并記錄分析。存活率（%）=胚胎存活數/胚胎總數×100%。孵化率（%）=已經孵化的胚胎數/胚胎總數×100%，心囊面積采用Image J軟件測定，心囊面積（mm2）=各尾魚的心囊面積之和/魚尾數。

Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.3 HE染色觀察斑馬魚眼部視網膜色素沉積

APAP 2，4 和8 mmol·L-1對4 hpf 的斑馬魚胚胎進行染毒，同時設有正常對照組。在72 hpf，用4%的多聚甲醛進行固定，4℃過夜后，次日，用含有0.05%吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with Tween-20，PBST）清洗2 次，每次60 min。再依次用20%、50%、70%、80%、90%和95%乙醇脫水，每次15 min，用100%乙醇清洗2次，每次15 min。再用二甲苯洗兩次置換乙醇，每次10 min，然后將斑馬魚放入60℃的石蠟中，40 min后，倒出部分石蠟，再添入新的石蠟，60 min 后，將浸有斑馬魚的石蠟放置在常溫，待石蠟凝固，用手術刀將蠟塊修成菱形，固定在木塊上。然后將木塊固定在切片機上進行切片。切片的厚度為5 μm，切下的蠟片放入電熱恒溫水槽42℃展平，將載玻片45℃伸入水槽中，用鉛筆拉動蠟片致載玻片上，將載玻片放置在平板凝膠真空干燥器上37℃干燥24 h 后，進行常規的HE 染色。HE 染色過程中，首先用二甲苯脫蠟兩次，每次10 min，然后依次入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇，80%乙醇和70%乙醇各2 min，蒸餾水5 min，蘇木精2 min，蒸餾水3 min，1%鹽酸乙醇21 s，蒸餾水30 s，0.5%氨水1 min，蒸餾水2 min，95%乙醇2 min，1.5%伊紅溶液30 s，95%乙醇2 min，100%乙醇2次，每次2 min，樹脂膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 ELISA法檢測TT3和TT4水平

對4 hpf 斑馬魚胚胎進行染毒7 d，收集正常對照組、APAP 2，4和8 mmol·L-1組幼魚各50尾，每個組設3個重復。用去離子水清洗，棄清洗液，稱重，按照每組魚質量與PBS 體積比為1∶20，加入pH=7.2 PBS，0℃下進行勻漿，將勻漿液于10 000×g，4℃離心5 min，取上清液，用ELISA 試劑盒進行斑馬魚TT3和TT4的含量檢測。

1.5 熒光定量PCR 檢測甲狀腺激素相關基因TPO，Trh，Dio2，Dio3，Thrα和Thrβ等的表達

給4 hpf 斑 馬 魚 胚 胎 暴 露APAP（2，4 和8 mmol·L-1），并設立正常對照組（每組10 尾，每個組設3 個復孔），暴露至72 hpf 時，各用去離子水清洗，棄去清洗液，加入100 μL焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）處理水。用勻漿器將斑馬魚充分打碎，加入900 μL Trizol，渦旋搖勻，加入200 μL氯仿，震蕩15 s，混勻，10 000×g離心15 min后，吸取上層500 μL水相至無RNA酶的離心管中，之后加入500 μL 的異丙醇，搖勻后室溫下靜置5 min，10 000×g 離心15 min 后倒出上清液，在離心管中加入75%冰乙醇1 mL，渦旋，10 000×g 離心15 min 后用槍頭吸出乙醇，再次加入1 mL 75%的冰乙醇清洗2 次，徹底將乙醇吸出后干燥10 min后加入30 μL DEPC 水，用基因測試儀測試所提取的RNA 濃度均＞240 mg·L-1，所有樣品A260nm/A280nm≥1.9，A260nm/A230nm≥1.6。轉錄采用逆轉錄酶2 μL、5×buffer 4 μL、5 mmoL·L-1dNTP 4 μL、RNA酶 抑 制 劑1 μL、特 異 下 游 引 物1 μL 和 總RNA 500 μg，最后加無核酸酶水至20 μL；于37℃2 h，85℃5 min，然后4℃冷卻5 min 后備用。SYBR Green I qRT-PCR 方法的建立：在20 μL 反應體系中，加入SYBR Green I PCR 反應混合液10 μL，每個基因（TPO，Trh，Dio2，Dio3，Thrα 和Thrβ）上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL（1 ng），H2O 7 μL。反應40 個循環。內參基因為18 s，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 APAP對斑馬魚胚胎存活率和孵化率的影響

斑馬魚存活率結果（圖1）顯示，與正常對照組相比，在24～72 hpf，APAP 各組斑馬魚的存活率變化無統計學差異；在96 hpf，APAP 8 mmol·L-1組斑馬魚的存活率顯著降低（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of N-acetyl-p-aminophenol（APAP）on survival rate of zebrafish embryos. Zebrafish embryos were exposed to APAP 0（normal control），2，4 and 8 mmol·L-1 at 4 hours post fertilization（4 hpf）and observed at 24，48，72 and 96 hpf，respectively. 30 eggs per group.s，n=10. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

斑馬魚胚胎孵化率統計結果（圖2）顯示，與正常對照組相比，在72 和96 hpf 時，APAP 8 mmol·L-1組斑馬魚胚胎的孵化率顯著下降（P＜0.01），其他組孵化率無統計學差異。

Fig.2 Effect of APAP on hatching rate in zebrafish embryos. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment.s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 APAP對斑馬魚胚胎心囊面積的影響

心囊面積結果（圖3）顯示，72 hpf時，與正常對照組相比，APAP 2，4 和8 mmol·L-1組的心囊面積分別增加了3.5，7.8和28.5倍（P＜0.01）。提示各濃度APAP都可引起不同程度心囊水腫。

Fig.3 Effect of APAP on pericardial area of zebrafish embryos at 72 hpf. See Fig.1 for zebrafish embryo treatmentn=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group. Arrows indicate pericardial edema.

2.3 APAP對斑馬魚視網膜黑色素的影響

斑馬魚視網膜黑色素沉積結果（圖4）顯示，72 hpf時，在正常對照組斑馬魚胚胎視網膜，黑色素在視網膜上均勻分布，色素沉著厚重。APAP 2 和4 mmol·L-1暴露組的黑色素在斑馬魚視網膜上分布不均，色素沉積降低；而8 mmol·L-1暴露組的黑色素分布尤為不均，色素沉積嚴重降低。提示各濃度APAP都可引起不同程度斑馬魚色素沉積降低。

2.4 APAP 對斑馬魚甲狀腺激素含量的影響

斑馬魚甲狀腺激素含量結果（圖5）顯示，從4 hpf給斑馬魚胚胎APAP 處理7 d，與正常對照組相比，APAP 8 mmol·L-1組斑馬魚組織勻漿TT3和TT4水平降低（P＜0.05，P＜0.01），APAP 2 和4 mmol·L-1組斑馬魚組織勻漿TT3 和TT4 水平與正常對照組無統計學差異。

Fig.4 Effect of APAP on pigmentation of retina of zebrafish eyes at 72 hpf（HE staining）. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment.Arrows indicated pigment in eyes.

Fig.5 Effect of APAP on levels of total 3，3′，5-triiodothyronine（TT3）and total 3，5，3′，5′-tetraiodothyronine（TT4）in zebrafish embryos at 7 d. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment. x±s，n=10. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 APAP 對斑馬魚甲狀腺激素關聯基因表達的影響

斑馬魚甲狀腺激素關聯基因表達結果（圖6）顯示，72 hpf時，與正常對照組相比，APAP 8 mmol·L-1組的TPO，Trh和Thrβ mRNA的相對表達量顯著降低（P＜0.01），Dio2，Dio3 和Thrα mRNA 的相對表達量無顯著變化。

Fig.6 Effect of APAP on mRNA expressions of TPO，Trh，Dio2，Dio3，Thrα and Thrβ in zebrafish embryos at 72 hpf. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment.，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究結果表明，APAP 給斑馬魚胚胎持續染毒，斑馬魚的形態發生心囊水腫變化，對斑馬魚的孵化率以及色素沉積有明顯的抑制作用，引起孵化率降低、色素沉積降低以及死亡率的增加。與甲狀腺激素密切關聯的TPO，Thrβ和Trh基因表達也顯著減低。

APAP對斑馬魚的孵化率有著明顯的抑制作用，引起發育遲緩。在各個染毒組中，隨著藥物濃度的增高，斑馬魚的發育抑制越嚴重，在72 hpf，8 mmol·L-1組斑馬魚的孵化率只有對照組的58.75%。經過組織切片也確認視網膜黑色素的減低。通過熒光定量PCR 檢測發現，APAP 有增高Dio2 基因表達，降低Dio3 基因表達的趨勢，這有可能是體內T3 的不足所造成的反饋調節，以利于更多的T3的生成和存留。這反映了APAP對斑馬魚甲狀腺素脫碘酶造成紊亂。

本研究中，與APAP 2 mmol·L-1組相比，4 mmol·L-1組Trh 基因表達有增高的趨勢，這可能與其標準差較大有關，但無顯著統計學意義，不影響整體結果分析以及結論。與正常對照組相比較，APAP 2 和4 mmol·L-1組Thrβ 基因的表達沒有濃度依存的降低，而8 mmol·L-1組Thrβ基因的表達顯著降低，這可能是由APAP低濃度代償引起。有關機制還有待進一步研究。

APAP 能夠通過胎盤屏障，對胎兒造成一定的影響，尤其是器官發育造成終生影響。APAP 主要用于解熱去痛，其原理是通過抑制環氧合酶1 和環氧合酶2，從而抑制前列腺素而發揮作用[18-19]，但對色素沉著的干擾的機理還不明了[20]。本研究不但發現色素的減低，還引起孵化率的顯著降低。斑馬魚體內甲狀腺素含量測定發現，APAP 造成TT3 和TT4 的顯著降低，推斷APAP 造成的毒性癥候群與甲狀腺激素紊亂相關聯。TPO 是甲狀腺激素合成的重要酶類，TPO 直接決定T4 和T3 的合成，而T3是斑馬魚胚胎變態發育中重要的激素，TPO基因表達的降低，勢必減少相關酶類的分泌而造成T4 和T3量的減少。T3量的減少將會引起斑馬魚胚胎發育障礙[17，21]，本研究結果提預示TPO基因表達量的降低致使T3 水平的降低，進而引起孵化率的降低。Trh 是垂體前葉的促甲狀腺激素釋放激素，主要刺激促甲狀腺激素的分泌，進而促進T4 和T3 的分泌。本研究發現，APAP 降低了Trh 基因的表達。Thrβ是T3的受體，Thrβ表達量的減低致使T3的結合受限，而不能發揮甲狀腺激素的機能，最終造成色素降低，孵化率低下以及形態學變化。這也與我們之前的研究相符，Thrβ表達量的降低可能引起斑馬魚胚胎色素的降低和發育障礙。

本研究結果顯示，APAP 可降低TPO，Trh 和Thrβ基因的表達，這可能與T3的含量變化有關，推測APAP 影響甲狀腺激素相關基因的表達，進而影響生長發育。