電感耦合等離子體質(zhì)譜測定尿銅不確定度評定

湯燕燕 陳金發(fā)

銅是人體必需元素，血液中的銅大約有40%與組氨酸或清蛋白結(jié)合，其余均與銅藍(lán)蛋白結(jié)合[1]。臨床上，尿銅作為診斷肝豆?fàn)詈俗冃缘闹匾獏⒖贾笜?biāo)，越來越多被應(yīng)用于研究[2-5]。檢測領(lǐng)域普遍認(rèn)為完整的測量結(jié)果應(yīng)包括測量不確定度。醫(yī)學(xué)實驗室測量不確定評定方法主要有“自上而下法”和“自下而上法”，前者被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實驗室測量不確定度評定[6-8]。當(dāng)“自上而下法”評定的測量不確定度達(dá)不到目標(biāo)不確定度時，可用“自下而上法”識別不確定度的各種來源，通過改進(jìn)產(chǎn)生主要影響因素的實驗過程，從而降低項目的測量不確定度。目前在衛(wèi)生相關(guān)領(lǐng)域，自下而上法評定不確定度的文章已有報道[9-10]。文章依據(jù)《測量不確定度評定和表示》[11]、《生物樣本測量不確定度評定與表示應(yīng)用指南》[12]，采用自下而上法對電感耦合等離子體質(zhì)譜測定尿銅的過程產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行評定，為改進(jìn)測量過程、降低測量不確定度提供一定的參考價值。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

渦旋振蕩器為廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司生產(chǎn)，型號為MS3 basic S25；微控數(shù)顯電熱板為萊伯泰科有限公司生產(chǎn)，型號為EH45A Plus；電子天平為英國艾德姆公司生產(chǎn)，型號為PWC184；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀為美國PerkinElmer公司生產(chǎn)，型號為NexION 350X；一體化超純水系統(tǒng)為美國Merck MILLIPORE公司生產(chǎn)，型號為ELIX Essential＋SynergyUV；多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液由美國PerkinElmer公司生產(chǎn)；優(yōu)級純濃硝酸為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；整個實驗過程所有用水均由一體化超純水系統(tǒng)制得。

1.2 實驗步驟

尿樣來自健康體檢的成人尿液，并按下述步驟對尿樣進(jìn)行前處理：首先使用振蕩器對尿樣進(jìn)行均勻振蕩，然后取30 mL的PFA溶樣罐，先后加入2.5 mL移液管吸取的尿及5 mL優(yōu)級純濃硝酸，輕加蓋，置于微控數(shù)顯電熱板，保持在80 ℃半小時后，將瓶蓋旋緊，待溫度上升至120 ℃后不再升溫，繼續(xù)消解至透明澄清。接著設(shè)置溫度為80 ℃，開蓋趕酸直至溶液剩余體積小于1 mL，隨后自然冷卻至室溫，用超純水作為溶劑定量至50 g，以0.22 μm濾膜過濾，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀采用外標(biāo)法對定容后的消解試液進(jìn)行測量。空白試驗、平行試驗以及加標(biāo)試驗按上述相同步驟同時進(jìn)行。

1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

用移液器準(zhǔn)確移取含銅濃度為100 μg/mL的多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液10 μL,加入到EP管中，加入990 μL超純水，用渦旋振蕩器混合均勻，得到含銅濃度為1 μg/mL的多元素混合工作溶液。各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制步驟為用適當(dāng)量程的移液器分別移取對應(yīng)體積含銅濃度為1 μg/mL的多元素混合工作溶液，以超純水作為溶劑，在天平上定量至10 g，渦旋振蕩器混勻。配制濃度、使用移液器量程和移取體積見于表1。

2 結(jié)果

2.1 項目不確定度的來源分析評定

2.1.1 建立數(shù)學(xué)模型

式中：X為尿樣中銅元素含量（單位：ng/mL）；ci為消解試樣溶液扣除空白對照后銅的質(zhì)量濃度（單位：ng/g）；M為消解液的定容質(zhì)量（單位：g）；v為試驗?zāi)驑芋w積（單位：mL）；frep為重復(fù)測量的影響因子。

2.1.2 項目各不確定度分量評定

根據(jù)上述構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型，尿樣中銅元素含量測定的不確定度來源包括尿樣體積移取產(chǎn)生的不確定度u（v）；消解試液中銅元素濃度測定過程產(chǎn)生的不確定度u（c）；電子天平定量消解液產(chǎn)生的不確定度u（M）；重復(fù)多次測量所產(chǎn)生的不確定度u（rep）。

2.2 項目各不確定度分量計算

2.2.1 試驗?zāi)驑芋w積移取產(chǎn)生的不確定度u（v）

2.2.2 消解試液中銅元素濃度測定過程產(chǎn)生的不確定度u（c）

表1 各濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程移液器產(chǎn)生的不確定度

表2 銅元素重復(fù)測定結(jié)果

表3 各不確定度分量的相對不確定度

2.2.2.4 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性擬合產(chǎn)生的不確定度u4（c）采用質(zhì)量濃度不同的5個標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性擬合，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液測1次，分別得到對應(yīng)的響應(yīng)值。為得到銅元素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以銅元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，每個濃度對應(yīng)測得的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到線性方程為：y=512.7x-233.54,該擬合曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.999 6。3個平行消解試液測得的響應(yīng)值（扣除空白對照后）分別為y1=4 089.7，y2=4 112.7，y3=4 084.8，代入方程計算得到3個消解液的濃度分別為，8.43 ng/g，8.48 ng/g，8.32 ng/g，平均值

其標(biāo)準(zhǔn)不確定度按如下公式計算：

式中：s為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸偏差；a為擬合曲線的斜率；；P為平行測量的次數(shù)（本實驗P=3）；N為擬合曲線數(shù)據(jù)點數(shù)（本實驗N=5）；c0為消解液的質(zhì)量濃度；為擬合曲線系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中銅元素的平均質(zhì)量濃度；ci為擬合曲線第 個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；yi為第i個標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的響應(yīng)值； b為擬合曲線的截距。

2.2.4 重復(fù)多次測量所產(chǎn)生的不確定度u（rep） 在相同條件下對試液中的銅元素濃度進(jìn)行7次測量，數(shù)據(jù)結(jié)果如表2。

2.3 項目不確定度分量的合成

2.4 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果

3 討論

文章利用電感耦合等離子體質(zhì)譜，采用外標(biāo)法，測定了人尿液中的銅元素的含量。同時采用自下而上的不確定度評定方法，對該測量過程的不確定度來源進(jìn)行了分析，并計算了模型下各個不確定度分量和合成不確定度。從表3可以看出，在所建立的數(shù)學(xué)模型中，合成不確定度的影響因素依次為消解試液中銅元素濃度測定過程產(chǎn)生的不確定度、重復(fù)多次測量所產(chǎn)生的不確定度、試驗?zāi)驑芋w積移取產(chǎn)生的不確定度、電子天平定量消解液產(chǎn)生的不確定度。試樣中銅元素濃度的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)儲備液本身、標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋過程、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程、系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線線性擬合過程產(chǎn)生的。它們產(chǎn)生的影響大小依次為系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程、多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋過程、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液線性擬合過程、標(biāo)準(zhǔn)儲備液本身。從文中可以發(fā)現(xiàn)，采用天平作為定容質(zhì)量工具，產(chǎn)生的不確定度較小，而移液器產(chǎn)生的不確定度較大。因此采用天平定量可提高實驗效率；同時，實驗過程中應(yīng)選用合適量程規(guī)格的移液器，且所使用的移液器應(yīng)該定時檢定計量。本實驗同時表明了擬合曲線的各標(biāo)準(zhǔn)點濃度選擇會影響不確定度，應(yīng)盡可能讓測量點落在線性的中間位置，儀器的靈敏度也會影響不確定度，應(yīng)對儀器做好期間核查，以確保靈敏度在正常范圍內(nèi)。

綜上所述，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定尿中銅元素含量的過程中，要使用純度足夠的標(biāo)準(zhǔn)試劑，選擇檢定合格且量程適合的量器具，并設(shè)計合理的工作曲線范圍，同時對所涉及的儀器、試劑、環(huán)境質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格管控，從而減小測量的不確定度，確保實驗的準(zhǔn)確性。通過對測量過程進(jìn)行不確定度評定和分析，可以讓實驗者更好的把握和控制實驗的每個環(huán)節(jié)，提高實驗效率，降低實驗誤差。