SPOCK1在大腸癌組織中表達(dá)的研究

畢丹丹 成秉林 李寶華 陳曉宇 張淑君

大腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)生率在惡性腫瘤中高居第3位，大腸癌患者死亡人數(shù)占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的8%左右，早期發(fā)現(xiàn)大腸癌的患者只占所有大腸癌總患病人數(shù)不到1%[1]。目前手術(shù)是結(jié)直腸癌的主要治療手段，手術(shù)切除后的5年生存率平均可達(dá)40%～60%，然而術(shù)后的局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移卻成了大腸癌患者死亡的最主要原因[2]。因此，提高大腸癌預(yù)后效果的關(guān)鍵在于如何盡早發(fā)現(xiàn)、診斷大腸癌并對(duì)其開(kāi)展規(guī)范化的手術(shù)治療。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是一種非細(xì)胞成分，存在于組織和器官中，蛋白多糖和纖維蛋白是其主要的兩種分子成分。ECM中的大分子被肽酶分解，使其不斷地處于動(dòng)態(tài)的重塑狀態(tài)，保持組織的分化和穩(wěn)態(tài)。肽酶的異常改變以及ECM的分解與合成之間平衡的破壞，都可以使ECM的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生明顯的改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。SPOCK1是一種由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞間質(zhì)中的ECM蛋白多糖，直接參與ECM的構(gòu)成，同時(shí)也是新發(fā)現(xiàn)的鈣離子結(jié)合蛋白多糖家族成員之一，對(duì)ECM的合成及積累起到了重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也可抑制肽酶的活性。近年來(lái)，因其具有促進(jìn)腫瘤形成、抑制腫瘤凋亡、促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)ECM重構(gòu)等生物學(xué)作用而備受關(guān)注與研究。

材料與方法

1.標(biāo)本來(lái)源:收集2014年7月1日～2015年5月31日哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科手術(shù)切除的19例新鮮大腸癌組織及癌旁組織標(biāo)本，每例標(biāo)本取2塊，將其中一塊標(biāo)本迅速放于-80℃冰箱中凍存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SPOCK1 mRNA；將另一塊標(biāo)本制成相應(yīng)的石蠟標(biāo)本。連同收集2007年7月1日～2012年2月28日病理科庫(kù)存的大腸癌及其癌旁石蠟標(biāo)本35例，共54例石蠟標(biāo)本切片進(jìn)行免疫組化。54例患者均出生于黑龍江省，其中男性33例(61.1%)，女性21例(38.9%)；患者年齡<60歲23例(42.6%)，患者年齡≥60歲31例(57.4%)；結(jié)腸癌41例(75.9%)，直腸癌13例(24.1%)；腫瘤直徑<5cm 39例(72.2%)，腫瘤直徑≥5cm 15例(27.8%)；大體類型為潰瘍型42例(77.8%)，隆起型10例(18.5%)，平坦型2例(3.7%)；組織學(xué)分級(jí)為低分化13例(24.1%)，中分化35例(64.8%)，高分化6例(11.1%)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例(37.0%)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例(63.0%)。所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)，未接受過(guò)放療和化療，并且由資深病理醫(yī)生進(jìn)行病理診斷和分級(jí)，實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本均設(shè)相應(yīng)的癌旁組織為對(duì)照。

2.主要試劑與儀器：主要試劑中Trizol購(gòu)自上海TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司，SPOCK1、GAPDH上下游引物由上海生工工程公司合成，兔抗人多克隆抗體SPOCK1購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)公司，抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，DAB濃縮顯色液購(gòu)自北京中杉金橋公司。主要儀器中real-time-PCR儀產(chǎn)自上海羅氏制藥有限公司，低溫高速離心機(jī)產(chǎn)自德國(guó)Eppendorf公司，超凈工作臺(tái)產(chǎn)自美國(guó)Thermo公司，制冰機(jī)產(chǎn)自日本Sanyo公司。

3.SPOCK1 mRNA表達(dá):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)大腸癌中SPOCK1 mRNA的表達(dá)。用Trizol分別提取19例新鮮組織標(biāo)本中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。SPOCK1上游引物：5′-CAACTGCTTGTTCCCAGAGG-3′，下游引物：5′-GCCAATGACTTCCC TATCCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度109bp；GAPDH 上游引物：5′-CAGGAGGCATTGCTG ATGAT-3′，下游引物：5′-GAAGGCTGGGGCTCAT TT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為138bp。根據(jù)Ultra SYBR Mixture試劑盒操作說(shuō)明書(shū)加樣：加入2×Ultra SYBR Mixture為1×10-5L；加入上游引物，10μmol/L為5×10-7L；加入下游引物，10μmol/L 為5×10-7L ；加入Template DNA 為8×10-7L；加入RNase-Free Water 為8.2×10-6L。反應(yīng)體系為20μl，35～40個(gè)循環(huán)，預(yù)變性95℃ 10min；變性95℃ 15s；退火/延伸 60℃ 1min；溶解曲線分析95℃ 15s、60℃ 1min、95℃ 15s、60℃ 15s。采用2-△△Ct分析法，Ct值是每個(gè)反應(yīng)管里的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定域值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，按照公式計(jì)算，擴(kuò)增的GAPDH作為內(nèi)參，將每個(gè)分組都設(shè)為3個(gè)復(fù)孔。△Ct=Ct平均值(目的基因)-Ct平均值(內(nèi)參)；△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct空白對(duì)照組。

4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)SPOCK1蛋白表達(dá):54例大腸癌石蠟標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)大腸癌SPOCK1蛋白的表達(dá)。標(biāo)本經(jīng)中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4μm組織切片。經(jīng)脫蠟、梯度水化后采用檸檬酸高溫高壓修復(fù)4min，放至室溫。在3%H2O2中常溫孵育0.5h，目的是將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性消除。非特異性抗原被山羊血清封閉0.5h之后，滴入1∶100比例的兔抗人多克隆抗體SPOCK1，放入4℃濕盒中過(guò)夜。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3min×3次。在抗兔二抗工作液37℃中孵育0.5h，用PBS溶液沖洗3min×3次。最后用DAB進(jìn)行顯色、蘇木素進(jìn)行復(fù)染、中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。

5.免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):SPOCK1表達(dá)陽(yáng)性的染色反應(yīng)呈現(xiàn)棕黃色，隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡視野。A：計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分比，陰性計(jì)0分，0～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～80%計(jì)3分，80%～100%計(jì)4分。B：按高比例陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞所呈現(xiàn)染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分，陰性的計(jì)0分，弱陽(yáng)性的計(jì)1分，陽(yáng)性的計(jì)2分，強(qiáng)陽(yáng)性的計(jì)3分。根據(jù)陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)和著色的強(qiáng)度得出綜合性的判斷，兩者相乘計(jì)分，乘積結(jié)果分別為0、1、2、3、4、6、9、12分，其中0～2分計(jì)為SPCOK1蛋白陰性表達(dá)，≥3分計(jì)為SPOCK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

結(jié) 果

1.SPOCK1 mRNA表達(dá):SPOCK1 mRNA在大腸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 SPOCK1 mRNA在大腸癌與癌旁組織中的表達(dá)

2.SPOCK1蛋白表達(dá)：SPOCK1屬于分泌型蛋白，其分泌到細(xì)胞間質(zhì)中參與ECM的構(gòu)成，主要表達(dá)于胞質(zhì)， 陽(yáng)性染色為棕黃色，呈顆粒狀(圖2)。54例大腸癌標(biāo)本中SPOCK1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，與正常組織中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。并且SPOCK1的陽(yáng)性表達(dá)和大腸癌組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與年齡、性別腫瘤部位、腫瘤直徑、大體類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

圖2 SPOCK1免疫組化染色A.SPOCK1在大腸癌組織中表達(dá)(×100)；B.SPOCK1在大腸癌組織中的表達(dá)(×400)；C.SPOCK1在癌旁組織中表達(dá)(×100)；D.SPOCK1在癌旁組織中表達(dá)(×400)

圖3 SPOCK1蛋白在大腸癌與癌旁組織中的表達(dá)

表1 SPOCK1陽(yáng)性著色和臨床病理學(xué)資料關(guān)系

臨床病理特征nSPOCK1陽(yáng)性表達(dá)χ2P年齡(歲) <6023210.647>0.05 ≥603126性別 男性33272.048>0.05 女性2120腫瘤部位 結(jié)腸癌41350.422>0.05 直腸癌1312腫瘤直徑(cm) <539340.003>0.05 ≥51513大體類型 潰瘍型4237 隆起型1092.201>0.05 平坦型21組織學(xué)分級(jí) 低分化1313 中分化353329.9<0.05 高分化61淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有20191.785>0.05 無(wú)3428浸潤(rùn)深度 漿膜/漿膜外48432.483>0.05 未穿透漿膜64遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 有870.002>0.05 無(wú)4640

3.SPOCK1蛋白的表達(dá)與大腸癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系：SPOCK1表達(dá)陽(yáng)性率在低分化大腸癌組織中為100%(13/13)，在中分化組織中為94.3%(33/35)，在高分化組織中為16.7%(1/6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.9，P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

討 論

許多惡性腫瘤患者術(shù)后無(wú)法達(dá)到很好的預(yù)后效果，甚至出現(xiàn)死亡的原因是腫瘤細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移會(huì)經(jīng)歷以下幾個(gè)步驟：腫瘤細(xì)胞之間黏附性改變，使原發(fā)灶脫落，脫落的腫瘤細(xì)胞分泌酶降解并穿過(guò)ECM屏障，侵入淋巴管和血管，并隨著血流在周圍組織或遠(yuǎn)端器官中建立新的腫瘤細(xì)胞集落[3]。因此在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，ECM屏障被降解是重要步驟，只有ECM屏障被降解，腫瘤細(xì)胞才能侵入血管，隨著血流轉(zhuǎn)移到其他器官[4]。

SPOCK1是一種ECM蛋白多糖，SPOCK1蛋白的發(fā)現(xiàn)是研究者提取睪丸精液中94000的蛋白多糖，為了檢測(cè)其主要成分，卻無(wú)意中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)序列，命名為testican，而后改名為SPOCK1。編碼此蛋白的SPOCK1基因定位于人染色體5q31區(qū)域，含硫酸軟骨素鏈及硫酸乙酰肝素鏈，其mRNA 長(zhǎng)度為5kb，包含12 個(gè)外顯子，開(kāi)放閱讀框架長(zhǎng)1.3kb， 3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)達(dá)3.3kb，約為其他基因非編碼區(qū)的4倍，并編碼SPOCK1蛋白的439個(gè)氨基酸殘基。SPOCK1的同源基因?yàn)镾POCK1，含有6個(gè)功能區(qū)域，部分區(qū)域能抑制蛋白酶活性。研究表明其第3號(hào)外顯子可以被選擇性地分解，從而發(fā)揮特定的靶向功能。SPOCK1同時(shí)又屬于鈣離子結(jié)合蛋白多糖家族的成員，共同特點(diǎn)是有著相似的N端、C端和含有卵泡素樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域，并參與細(xì)胞的增殖、黏附及轉(zhuǎn)移。蛋白多糖家族除了SPOCK1之外還包括SPARC、testican-2及testican-3。

近期研究發(fā)現(xiàn)，SPOCK1不僅在食管鱗狀細(xì)胞癌、膽囊癌、肝癌、肺癌及胰腺癌中有高表達(dá)，而且其表達(dá)的程度也與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的短期存活時(shí)間有明顯的相關(guān)性。特別要強(qiáng)調(diào)的是，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)，SPOCK1不僅可以作為膽囊癌患者的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)，也可以對(duì)胰腺癌和肝癌的預(yù)后起到一定的參考價(jià)值[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)，SPOCK1在前列腺癌中表達(dá)量較高,特別在已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的情況下癌組織SPOCK1表達(dá)量更高；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)SPOCK1能促進(jìn)前列腺癌的增殖，抑制其凋亡，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌、尿路上皮癌、卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中也能發(fā)揮一定的促進(jìn)作用[7～13]。此外，研究表明SPOCK1的高表達(dá)會(huì)影響胰腺癌及乳腺癌的預(yù)后[14～16]。

本研究通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)到SPOCK1基因在癌變組織中的表達(dá)明顯高于正常組織中，同時(shí)應(yīng)用IHC檢測(cè)到大腸癌中SPOCK1蛋白也同樣高表達(dá)，表明SPOCK1也許能促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SPOCK1明顯和大腸癌的組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)。雖然在研究SPOCK1與大腸癌患者臨床特征中，SPOCK1和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性不明顯(P=0.915)，但是考慮到納入研究的標(biāo)本量有限，提高研究的標(biāo)本量或許能有新的發(fā)現(xiàn)。SPOCK1作為分泌型蛋白，可以在組織中被靈敏的檢測(cè)出來(lái)，SPOCK1或許可以作為大腸癌早期檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物。筆者下一步重點(diǎn)要研究SPOCK1在大腸癌中是如何發(fā)揮促進(jìn)腫瘤形成、抑制腫瘤凋亡作用的。