CFTR 2562T>A位點多態性與急性胰腺炎風險的相關性

金 爽 金光軍

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是由于多種病因引起的胰酶激活，導致胰腺局部發生炎性反應，嚴重情況下可以導致全身炎性反應綜合征并發生器官功能障礙的疾病[1]，近年來急性胰腺炎的發生率逐漸上升，病死率也較高[2]。急性胰腺炎的發病機制比較復雜，其中遺傳因素在急性胰腺炎的發生過程中具有重要作用，成為研究的熱點[3,4]。囊性纖維跨膜轉運調節因子(cystic fiber transmembrane transport regulatory factor，CFTR)是一種氯離子(Cl-)通道蛋白，具有調節Cl-和鈉離子(Na+)交換的功能[5]。國外有研究者發現CFTR基因多態性與慢性胰腺炎相關[6,7]。目前國內還鮮有研究報道CFTR基因多態性與急性胰腺炎的相關性。本研究采用病例對照研究的方式分析CFTR基因rs1042077(2562T>A)位點單核苷酸多態性與急性胰腺炎風險的相關性，具體研究報告如下。

對象與方法

1.一般資料：選擇2015年12月～2017年10月期間收治的AP患者100例作為研究對象，AP的診斷標準：(1)有符合AP特征的腹痛，如急性、持續、突發且劇烈的上腹疼痛。(2)血清淀粉酶或脂肪酶活性≥3倍正常值上限。(3)增強磁共振成像(MRI)檢查或增強計算機斷層掃描(CT)檢查或者腹部的超聲檢查顯示有AP影像學改變。考慮到臨床工作中AP患者多為輕度AP，為了更好地研究FTR基因rs1042077(2562T>A)位點單核苷酸多態性與急性胰腺炎嚴重程度相關性，降低誤差，筆者在納入病例時盡量保證輕度、中重度、重度AP患者病例數接近，結合知情同意書的簽署情況，最終入組的輕度AP(mild acute pancreatitis，MAP)23例，中重度AP(moderate severe acute pancreatitis，MSAP)42例，重度AP(severe acute pancreatitis，SAP)35例。MAP、MSAP、SAP的分級標準參考[8]。納入標準：(1)符合AP的診斷標準。(2)年齡>18歲。(3)初診為AP且發病后2天內入院治療。排除標準：(1)腫瘤患者。(2)有重要臟器疾病、消化系統疾病。(3)妊娠期或哺乳期婦女。(4)精神類疾病患者。招募100例健康體檢者作為對照組(health control，HC)。本研究中AP組和HC組一般資料詳見表1，兩組年齡、性別、體重指數(body mass index，BMI)、收縮壓(systolic pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)等一般資料之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得了醫院醫學倫理學委員會的批準，所有受試者均簽署了知情同意書。

表1 研究組和對照組一般資料比較

BMI.體重指數；SBP.收縮壓；DBP.舒張壓

2.AP病情評價：采用Balthazar CT嚴重指數(CTSI)對AP患者的胰腺炎嚴重程度進行評分，0～3分表示為輕度、4～6分表示為中重度、7～10分表示為重度。使用APACHE Ⅱ評價AP患者的身體狀況，包括急性生理學評分、年齡評分以及慢性生理學評分等3個維度。

3. CFTR基因型檢測：提取所有受試者外周靜脈血中基因組DNA，試劑盒為天根血液基因組DNA提取試劑盒(貨號為DP318-02，批號為20150512100，公司為天根生物科技有限公司)。以提取的基因組DNA為模板，擴增含有CFTR基因rs1042077位點的目的片段，PCR擴增的引物序列為上游引物：5′-GAGAGCATACCAGCAGTGAC-3′；下游引物：5′-ACTAAGCACCAAATTAGCACAAA-3′。PCR反應程序設置為94℃變性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s；30個循環后72℃延伸5min，PCR產物保存在4℃冰箱，將PCR產物郵寄到上海生工生物工程有限公司，測序后使用Chromas 1.62分析測序結果(圖1)。

圖1 CFTR基因rs1042077(c.*2562T>A)位點不同基因型測序結果

結 果

1.CFTR基因rs1042077位點SNP與AP風險的相關性：CFTR基因rs1042077位點不同基因型頻率符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)。AP組患者與HC組比較，CFTR基因rs1042077位點基因型和等位基因頻率之間比較，差異有統計學意義(χ2分別為6.91、8.05；P值分別為0.03、<0.01)。以野生型(TT)為參考，雜合子(TA)頻率在AP組和HC組之間比較，差異無統計學意義(OR=0.57，95%CI：0.30～1.10，P=0.07)，純合子(AA)是AP發生的保護因素(OR=0.34，95%CI：0.12～0.93，P=0.02)。等位基因分析結果顯示，A等位基因是AP發生的保護因素(OR=0.53，95%CI：0.34～0.85，P=0.01)，詳見表2。

表2 CFTR基因rs1042077位點基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

AP.急性胰腺炎;HC.健康對照組;OR.比值比;CI.可信區間

2. CFTR rs1042077位點基因多態性與一般資料的相關性：分析CFTR rs1042077位點基因多態性與受試者年齡、性別、BMI、SBP、DBP等一般資料之間的相關性，野生型(TT)與突變型(TA/AA)的年齡、性別、BMI、SBP、DBP等一般資料之間比較，差異無統計學意義(P均>0.05)，詳見表3。

表3 CFTR基因型與一般資料的相關性

BMI.體重指數；SBP.收縮壓；DBP.舒張壓

3.CFTR rs1042077位點基因多態性與APACHE Ⅱ評分和CTSI評分的相關性：分析比較AP患者CFTR rs1042077位點野生型和突變型患者的APACHE Ⅱ評分和CTSI評分，野生型AP患者APACHE Ⅱ評分和CTSI評分均顯著高于突變型，差異有統計學意義(t=7.66、12.41；P均<0.01)，詳見表4。

表4 AP組CFTR基因型與APACHE Ⅱ評分和CTSI評分的相關性

4.CFTR rs1042077位點基因多態性與AP嚴重程度相關性：本研究AP患者中35例SAP，42例MSAP，23例MAP，分析CFTR基因rs1042077位點多態性與AP嚴重程度相關性，CFTR基因rs1042077位點野生型和突變型基因頻率在不同AP嚴重程度患者組之間的差異有統計學意義(t=19.82，P=0.000)，突變型(TA/AA)基因頻率在SAP組和MSAP組中較低，詳見表5。

討 論

CFTR是胰腺、膽管和腸道等上皮細胞游離膜上的一種Cl-通道，具有調節離子濃度、水分流動和鹽類離子轉運的作用[9,10]。CFTR結構異常可能導致上皮層的離子和液體轉運發生異常，使細胞內水分流失、分泌活動異常，導致局部組織阻塞繼而發生感染[11]。

表5 CFTR rs1042077位點不同基因型頻率在不同嚴重程度AP患者中的分布[n(%)]

SAP.重度AP;MSAP.中重度AP;MAP.輕度AP

自從CFTR基因被鑒定以來，該基因上有接近2000個突變類型被發現，包括點突變、小缺失突變等[12]。有多種疾病被發現與CFTR基因突變有關，如先天性雙側輸精管缺如(CBAVD)、阻塞性精子癥、播散性支氣管擴張癥、哮喘、慢性胰腺炎(CP)和新生兒高尿酸血癥等[13～17]。CFTR基因rs1042077(2562T>A)位點位于7號染色體exon 14上，據1000 Genomes Project 數據庫研究數據顯示該位點突變在中國南方漢族人群中最小等位基因頻率(MAF)為0.3857，本研究中健康對照組MAF為0.365，說明本研究所選擇的人群具有一定的代表性，比較結果較為可靠。rs1042077位點在dbSNP中顯示MAF為44%，在ClinVar中被解釋為“良性/可能良性”。而本研究結果顯示，在AP患者中，rs1042077位點MAF為0.235，且AP組患者與HC組比較，CFTR基因rs1042077位點基因型和等位基因頻率之間的差異有統計學意義(P<0.05)，由此說明CFTR基因rs1042077位點單核苷酸多態性與AP的發生相關，具體表現為攜帶突變型A等位基因的群體可能比T等位基因攜帶者患AP概率更低。

本研究結果顯示，CFTR基因rs1042077位點A等位基因是AP發生的保護因素。然而，目前對于CFTR基因突變的研究大多集中以下幾個區域，如Vecchio-Pagán等[18]研究結果顯示，CFTR基因A區域(chr7: 117039250～117053000)的調節基因座與汗液氯化物水平和肺功能相關，B區域(chr7: 116941750～116951750)、C區域(chr7: 117074250～117078000)、D區域(chr7: 117153000～117156750)與汗液氯化物水平相關，而E區域(chr7: 117010500～117014250)和F區域(chr7: 117159250～117164250)與肺功能相關。而國內外針對CFTR基因rs1042077位點的研究較少，從結構上看該位點不屬于以上這幾個區域，由于該位點突變頻率較高，因此研究該位點與疾病的相關性具有顯著的臨床意義。

此外，分析不同臨床參數群體間CFTR基因rs1042077位點基因型頻率之間的差異，結果并未發現CFTR基因rs1042077位點基因多態性與年齡、BMI、SBP、DBP等之間具有相關性，說明CFTR基因rs1042077位點基因多態性對AP發生的影響與上述因子無關，通常單核苷酸多態性對表達的影響主要體現在結構、功能或者調控水平上，由于rs1042077位點T>A突變并未改變氨基酸的序列，筆者推測可能是影響了CFTR的表達水平。研究顯示，CFTR蛋白在胰腺癌和慢性胰腺炎中呈現弱表達水平，顯著低于正常胰腺組織，因此筆者認為rs1042077位點T>A突變可能影響CFTR表達調控過程，導致CFTR蛋白的表達水平升高，從而對AP的發生具有保護效應，但是還需要進一步開展體外實驗予以證實。另外，本研究還分析了CFTR rs1042077位點基因多態性與AP嚴重程度的相關性，攜帶野生型(TT)的AP患者APACHE Ⅱ評分和CTSI評分均顯著高于突變型，而突變型(TA/AA)基因頻率在SAP組和MSAP組中較低，說明CFTR rs1042077位點單核苷酸多態性與AP的嚴重程度相關，突變型AP患者的病情比野生型輕。

本研究有以下不足之處，首先受樣本量大小的限制，部分基因型受試者數量較少，這可能放大了統計學誤差。另外，由于本研究未能在體外模型中檢驗CFTR rs1042077位點單核苷酸多態性與CFTR蛋白表達的相關性，因此對于CFTR rs1042077位點單核苷酸多態性與AP的相關性的機制缺乏直接的證據支持。

綜上所述，CFTR基因rs1042077位點單核苷酸多態性與急性胰腺炎及其嚴重程度相關，突變型A等位基因可能是AP發生及其嚴重程度的保護因素，具體機制還需要進一步研究證實。