ICP-MS法同時測定小牛血去蛋白提取物注射液中14種元素的含量Δ

邵天舒，周長明，余立，郭雷（北京市藥品檢驗所中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京102206）

因來源和組分的復雜性，由動物組織器官提取制備的多組分生化藥已成為備受學者關注的焦點和相關藥品質量控制研究的熱點[1]。小牛血去蛋白提取物是將新生小牛靜脈血去除蛋白質后，經透析、濃縮、超濾等工藝制成的含有小分子多肽、氨基酸及無機元素等的混合物，該藥主要用于腦缺血、癡呆、腦外傷及大腦功能不全等腦細胞代謝障礙性疾病的治療[2]。目前，有關該藥質量控制方面的研究主要為其活性組分如多肽、氨基酸以及鈉鉀離子的含量檢測[3-4]，而對于其中元素控制方面尚無文獻報道，且現行國家藥品標準WS1-XG-029-2000和進口藥品注冊標準JX20030248中也未見對該藥中元素控制的相關項目[5-6]。

近年來，隨著環境污染日益嚴重，動物在養殖過程中的飲用水、飼料受到有害元素如汞（Hg）、鉛（Pb）、砷（As）、鎘（Cd）、鋁（Al）等污染的概率也隨之增加，且金屬元素易與動物體內的多肽、蛋白質等成分螯合，使得金屬元素在動物組織器官來源的藥物中形成殘留[7]。過量的Hg可危害人體中樞神經系統，As則會影響細胞代謝，Pb對神經系統、消化系統和造血系統都有毒性作用，Cd中毒可能會導致腎功能損傷及骨骼軟化[8]，Al在體內的蓄積可能具有引發軟骨病、低血色素性貧血、老年性癡呆和慢性腎功能損傷等潛在風險[9]?，F行2015年版《中國藥典》（四部）通則“0102”對中藥注射劑中部分元素按每日最大使用量進行逐一限量規定[10]。因此，對小牛血去蛋白提取物注射液中元素進行監測對保障用藥安全具有重要意義。

電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）具有靈敏、準確、快速的優點，已成為同時測定多種痕量元素含量的首選方法[11-12]。本研究采用ICP-MS法同時測定了國內外3家企業24批小牛血去蛋白提取物注射液中Cd、Pb、As、Hg、鈷（Co）、釩（V）、鎳（Ni）、鉈（Tl）、銀（Ag）、鉬（Mo）、銅（Cu）、鉻（Cr）、鋇（Ba）、Al等14種元素的含量，旨在為深入研究該藥中各元素的分布及來源、臨床用藥的安全性評估及質量標準的提升提供依據，為類似的多組分生化藥中多種元素的控制提供參考，為注射劑仿制藥一致性評價中的元素控制提供支持。

1 材料

1.1 儀器

NexlON 300X型ICP-MS儀，包括霧化器、四級桿、檢測器（美國Perkin Elmer公司）；WD-A型藥物穩定性檢查儀（天津藥典標準儀器廠）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q型超純水機（美國Millipore公司，電阻率：18.2 MΩ·cm）。

1.2 藥品與試劑

小牛血去蛋白提取物注射液（進口A企業，批號：00911015、00921015、00931015、00941015、00951015、00961015、00971015、00991115、10923971、10924161、10924163、10946880、10946882、10958367、10960009，規格：10 mL∶400 mg，編號：S1～S15；國產 B 企業，批號：181013-2、181014-2、181015-2、1705003-2、1705004-2、1705005-1，規格：10 mL∶400 mg，編號：S16～S21；國產C企業，批號：10618023-2，規格：5 mL∶200 mg；批號：10718065-3、10718079-2，規格：10 mL∶400 mg；編號：S22～S24）；Hg標準品溶液（中國計量科學研究院，批號：GBW08617/18031，質量濃度：1 000 μg/mL）；Cd、Pb、As、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al混合標準溶液（批號：3-122MKBY2，質量濃度均為10 μg/mL）以及鉍（Bi）、鍺（Ge）、銦（In）、銣（Lu）、銠（Rh）、鈧（Sc）混合內標貯備液（批號：3-62MKBY2，質量濃度均為100 μg/mL）均購自美國Agilent公司；金（Au）標準品溶液（美國Inorganic Ventures公司，批號：K2-AU04064，質量濃度：1 000 μg/mL）；硝酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 ICP-MS條件

射頻功率：1 350 W；載氣（氬氣）流量：1.1 L/min；碰撞氣（氦氣）流量：4.5 L/min；積分時間：1.5 s；等離子體氣流量：18 L/min；采樣深度：65 mm；進樣蠕動泵轉速：24.0 r/min；數據采樣模式：跳峰模式；重復次數：3次。各元素分析參數見表1。

表1 各元素分析參數Tab 1 Analytical parameters of each element

2.2 溶液的制備

2.2.1 內標溶液 精密量取混合內標貯備液1 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得各內標元素質量濃度均為1 μg/mL的內標溶液。

2.2.2 混合標準品溶液 精密量取混合標準溶液0.5mL，置于10 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得各元素質量濃度均為500 μg/L的混合標準品貯備液。精密量取Hg標準品溶液1 mL，置于20 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，取1 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為500 μg/L的Hg標準品貯備液。分別精密量取上述混合標準品貯備液及Hg標準品貯備液0.01、0.1、0.2、1、4、10、14 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入“2.2.1”項下內標溶液及Au穩定劑溶液（取Au標準品溶液適量，加1%硝酸溶液定容至刻度，制得質量濃度為1 μg/mL的Au穩定劑溶液）各1 mL，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得各元素質量濃度分別均為0.05、0.5、1、5、20、50、70 μg/L的系列混合標準品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密量取樣品2 mL，置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入“2.2.1”項下內標溶液和“2.2.2”項下Au穩定劑溶液各1 mL，加1%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 空白溶液 以1%硝酸溶液為空白溶液。

2.3 線性關系考察

取“2.2.2”項下系列混合標準品溶液各適量，按“2.1”項下ICP-MS條件連續進樣，記錄儀器響應值。以各待測元素質量濃度（x，μg/L）為橫坐標、各待測元素與內標的響應值比值（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equation and linear range

2.4 定量限與檢測限考察

取“2.2”項下空白溶液和系列混合標準品溶液各適量，按“2.1”項下ICP-MS條件連續進樣測定10次，記錄儀器響應值并計算標準偏差。以標準偏差與標準曲線斜率之比的10倍對應的元素質量濃度作為定量限，以標準偏差與標準曲線斜率之比的3倍對應的元素質量濃度作為檢測限，結果見表3。

表3 定量限與檢測限結果Tab 3 Quantitation limits and detection limits

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.2”項下混合標準品溶液（質量濃度為20 μg/L）適量，按“2.1”項下ICP-MS條件連續進樣測定6次，記錄儀器響應值。結果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al儀器響應值的 RSD 分別為3.6%、4.2%、1.5%、3.7%、3.7%、2.2%、0.4%、1.6%、3.4%、0.9%、2.7%、2.1%、1.5%、0.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密量取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：S24）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下ICPMS條件進樣測定，記錄儀器響應值。結果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al儀器響應值的RSD分別為3.2%、4.0%、1.9%、7.8%、2.2%、3.0%、2.1%、1.9%、4.2%、2.0%、3.4%、2.5%、3.6%、3.8%（n＝6），表明供試品溶液于室溫放置10 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

精密量取樣品（編號：S24）1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應值并按內標法計算樣品中14種元素的含量。結果，Cd、Pb、As、Hg、Co、V、Ni、Tl、Ag、Mo、Cu、Cr、Ba、Al的平均含量分別為0.201 5、0.091 3、0.100 4、0.077 6、0.039 4、0.094 6、0.998 9、0.115 1、0.280 6、0.412 6、0.034 9、1.625 3、5.999 4、14.146 6 μg/L，儀器響應值的RSD分別為4.4%、6.4%、2.8%、5.4%、4.8%、3.8%、1.6%、3.9%、4.0%、1.0%、2.6%、2.2%、2.8%、1.5%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（編號：S24）2 mL，共9份，分別置于100 mL聚四氟乙烯量瓶中，加入低、中、高質量濃度的混合標準品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應值并計算加樣回收率，結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 4 Results of recovery tests（n＝9）

續表4Continued tab 4

續表4Continued tab 4

2.9 樣品含量測定

取24批樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應值并按內標法計算樣品中各元素的含量，結果見表5（表中，“-”表示未檢出，下同）。

2.10 每日最大暴露量（PDE）分析

國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）發布的指導原則“Q3D”中將藥品所含的元素（除Al外）按其風險由高到低分為1類（包括Cd、Pb、As、Hg）、2A類（包括Co、V、Ni、Tl）、2B 類（Ag）及 3類（包括 Mo、Cu、Cr、Ba），并對各元素按口服、注射、吸入等3種不同劑型分別規定了PDE[13]。按照該指導原則，根據公式：PDE＝樣品中各元素的質量濃度×日服用劑量，將表5中（除Al外）各元素的含量結果進行換算，結果見表6。

由表6可知，24批樣品中13種元素均未超過出ICH的限量值[13]。國產C企業的3批樣品中Cd含量分別達到限量值的25%、40%、25%，Pb、As、Hg均未超過ICH限量值的15%，其他元素均未超過ICH限量值的20%。提示該藥含有的元素含量水平雖然存在差異，但均低于ICH限量值，因此該藥用于臨床是安全的。

表5 樣品含量測定結果（n＝3，μg/L）Tab 5 Results of content determination of samples（n＝3，μg/L）

2.11 Al含量分析

將24批樣品（與已測定的樣品同批號但未開封）分別于25、45 ℃放置60 d后，取適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下ICP-MS條件進樣測定，記錄儀器響應值并按內標法計算樣品中Al的含量，結果見表7。

Al在ICH指導原則Q3D中被認定為“可能導致損傷的其他元素雜質”[13]，但未給出限量值，其限量值可遵從其他指導原則和/或地方法規和規范，如現行《美國藥典》（41版）規定了全腸外營養治療用大容量注射液中Al含量限量為 25 μg/L[14]；《歐洲藥典》（9.0版）和 2015 年版《中國藥典》（三部）均規定人血白蛋白注射液中Al含量限量為200 μg/L[10，15]。因此，小牛血去蛋白提取物注射液說明書參照上述文獻的規定，設定Al含量限量為200 μg/L。

由表7可知，3家企業各批樣品中Al含量在放置60 d后均有所升高。25℃條件下，A、B、C企業樣品中Al含量分別平均升高了14.8%、2.5%、67.9%；45℃條件下，分別平均升高了51.5%、19.1%、165.8%，放置前Al含量較高的在放置后升高程度越明顯。國產B企業樣品在放置前Al含量最低，45℃放置60 d后，Al含量的最高值為113.513 μg/L（編號：S20），仍未超過200 μg/L的限量值；所有企業中，僅國產B企業6批樣品中的Al含量符合上述限量要求。

表6 13種元素的PDE（μg/d）Tab 6 Permitted daily exposure of 13 elements（μg/d）

表7 不同溫度條件下放置60 d后Al含量比較（n＝3）Tab 7 Comparison of aluminium content after 60 days storage at different temperatures（n＝3）

3 討論

3.1 樣品前處理方式的選擇

前期預試驗發現，采用微波消解樣品后，雖然可以使樣品中的肽類成分得到有效破壞，但消解過程中使用的硝酸會引入一定量的待測元素，而造成空白值明顯升高，加之濃酸的揮發以及溶液轉移過程可能會造成樣品中待測元素損失，進而使樣品測定結果的準確度降低，因此微波消解法并不適用。另外，由于樣品中添加的輔料為2.68%氯化鈉，這超出了ICP-MS儀器測定樣品時的溶液含鹽量限量（不超過0.05%），因此直接測定法不適用。綜合考慮，筆者分別嘗試將樣品經1%硝酸溶液稀釋10倍、20倍、50倍和100倍后進樣測定。結果顯示，當樣品稀釋10倍或20倍時，部分元素的加樣回收率接近150%，且內標元素的響應值與標準品溶液測定時比較明顯降低，提示基質干擾較嚴重；當樣品稀釋100倍時，由于稀釋度過大，使得樣品中部分元素的測定結果低于定量限，而影響測定的準確性。因此，選擇將樣品稀釋50倍后測定，經方法學驗證均符合2015年版《中國藥典》（四部）的相關要求[10]。

3.2 測量模式的選擇

前期預試驗中，筆者采用標準模式和動能歧視模式對各待測元素進行方法學驗證。結果顯示，采用動能歧視模式測定時，As、V、Cr等3種元素的檢測限均低于標準模式一個數量級以上，其他元素采用兩種模式測定時則無明顯差異?？紤]到碰撞氣（氦氣）價格較為昂貴，以及為提高檢測結果的準確度，最終選擇動能歧視模式測定As、V、Cr，采用標準模式測定其他11種元素。

3.3 Al含量結果分析

本研究結果顯示，國產B企業的6批樣品中Al含量（編號：S16～S21）符合規定（Al含量限量為200 μg/L），進口A企業和國產C企業的樣品均超出限量值，特別是國產C企業的3批樣品（編號：S22～S24）中Al含量均高達限量值的3～4倍。其原因可能為各企業使用的玻璃容器質量不同，在放置過程中，玻瓶容器中的金屬離子向藥品發生了遷移。不同企業生產的樣品中Al含量差異較大，部分企業的樣品中Al含量超過限量值問題應引起重視，特別是靜脈注射劑中過量的Al長期直接注入血液，可引起骨軟化、阿爾茨海默病、低色素性貧血、慢性腎功能損傷等潛在風險[16]，因此在現行質量標準中增加對Al含量進行監控就顯得十分必要。此外，3家企業樣品的保質期各有不同，國產B企業為18個月，C企業為24個月，進口A企業為60個月。由于玻瓶容器中Al可隨貯藏時間的延長而不斷浸出，因此建議重新設定該樣品的有效期，以保障用藥的安全性。

綜上所述，該方法操作簡便、準確，精密度、穩定性、重復性均較好，可用于同時測定小牛血去蛋白提取物注射液中14種元素的含量。