正交設(shè)計優(yōu)化雙斛膠囊中總生物堿的醇提取工藝Δ

陳寬，單冰冰，李婷，田富月，張建永（遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州遵義563000）

酒精性肝損傷（Alcoholic liver disease，ALD）是指酒精性脂肪肝、酒精性肝纖維化、酒精性肝炎以及包括酒精性肝硬化在內(nèi)的因長期大量飲酒等導(dǎo)致的肝中毒性損傷[1]。目前ALD的發(fā)病機制尚未闡明，其治療方法主要包括對癥用藥和引導(dǎo)患者戒酒等[2]。中醫(yī)認為，ALD的治療可從病位和病性兩方面入手，其病位在肝，與膽、脾、胃密切相關(guān)，濕毒、火熱為其主要病性證素[3]。由此可見，ALD的治療應(yīng)注意化濕熱、利小便，以達到消熱散結(jié)、酒邪內(nèi)解等目的[4]。祁培宏等醫(yī)家根據(jù)臨床經(jīng)驗的自擬方劑、現(xiàn)有上市的中成藥及單味藥等對ALD均具有一定的治療效果[5-6]。

石斛藥材來源于蘭科植物金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl.）或流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖；鐵皮石斛藥材來源于蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura Migo）的干燥莖[7]。據(jù)2015年版《中國藥典》（一部）記載，金釵石斛和鐵皮石斛均具有益胃生津、滋陰清熱之效，可用于治療熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足和陰虛火旺等癥[7]。金釵石斛含有生物堿、聯(lián)芐等成分，主要有效成分為生物堿；鐵皮石斛主要含有多糖、氨基酸等成分，其中多糖為其指標性成分[8-9]。現(xiàn)有研究表明，石斛生物堿可緩解高脂血癥模型大鼠肝臟脂肪變性等癥狀，而石斛多糖在改善酒精導(dǎo)致的肝功能損傷和脂質(zhì)代謝紊亂等方面具有一定作用[10-11]，由此推測石斛中的這兩類成分有可能發(fā)揮協(xié)同功效。本課題組在石斛的中醫(yī)傳統(tǒng)治療應(yīng)用的經(jīng)驗基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果，優(yōu)選金釵石斛和鐵皮石斛，以兩種石斛的優(yōu)勢成分群（即總生物堿和總多糖）作為活性成分，通過現(xiàn)代提取和制劑技術(shù)，研制出對亞急性ALD具有緩解和改善作用的雙斛膠囊，該制劑根據(jù)2015年版《中國藥典》（一部）中成人日服量規(guī)定[7]，將金釵石斛和鐵皮石斛的用量均設(shè)為4 g（即兩種藥材質(zhì)量比為1∶1）。該制劑的提取工藝主要分為兩個步驟：首先對金釵石斛和鐵皮石斛的混合物進行醇提以獲得總生物堿部分，將醇提后的藥渣再進行水提以獲得總多糖部分。筆者在本文中以干膏得率和總生物堿含量為指標，采用正交設(shè)計優(yōu)化雙斛膠囊總生物堿的提取工藝，旨在為后期總多糖的提取及雙斛膠囊的深入開發(fā)奠定工藝基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BT125D型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯（中國）科學(xué)儀器有限公司]；FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；TU-1900型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；AXTGL16M型高速冷凍離心機（鹽城市安信試驗儀器有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海上登實驗設(shè)備有限公司）；FW135型中藥材粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；XH-B型旋渦渦旋儀（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）。

1.2 藥品與試劑

石斛堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111876-201503，純度：100.0%）；無水乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀（成都金山化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷、濃鹽酸（重慶川東化工有限公司）；氨水（重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑公司）；溴甲酚綠（天津市大茂化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

金釵石斛（批號：20170324）、鐵皮石斛（批號：20170324）由重慶市渝和堂藥業(yè)有限公司提供并進行鑒定及檢測，均產(chǎn)自云南，均符合2015年版《中國藥典》（一部、四部）“中藥材與飲片”項下石斛和鐵皮石斛的性狀、鑒別及含量測定有關(guān)規(guī)定，以及“中藥其他方法”項下浸出物測定、雜質(zhì)檢查、灰分測定、二氧化硫殘留量測定的有關(guān)規(guī)定。

2 雙斛膠囊中總生物堿的含量測定

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 取石斛堿對照品適量，精密稱定，加三氯甲烷制成20.80μg/mL的對照品母液；后續(xù)試驗取該母液，以三氯甲烷稀釋成相應(yīng)溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉（按質(zhì)量比1∶1混勻，過30目篩，下同）混合物8 g，置于圓底燒瓶中，以一定量、一定體積分數(shù)的乙醇浸泡后，加熱回流提取數(shù)次（具體參數(shù)見后續(xù)正交試驗優(yōu)選工藝）；合并醇提液，放冷，3 500 r/min離心15 min，取上清液，加70%乙醇定容至500 mL，搖勻，于5℃下以3 500 r/min離心15 min；取上清液100 mL，水浴蒸干，殘渣用5%稀鹽酸70 mL溶解，搖勻，3 500 r/min離心10 min；取上清液，加濃氨水調(diào)節(jié)pH至10，精密吸取5 mL，用等體積三氯甲烷萃取3次，合并下層，以三氯甲烷稀釋定容至25 mL，搖勻，即得。

2.2 檢測波長選擇

取按“2.1.1”和“2.1.2”項下方法制備的對照品溶液（4.16 μg/mL）和供試品溶液，采用酸性染料比色法[12]進行顯色反應(yīng)：向?qū)φ掌啡芤夯蚬┰嚻啡芤褐屑尤雙H 4.5的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5.0 mL和0.04%溴甲酚綠溶液2.0 mL，渦旋3 min萃取，靜置30 min待分層；取下層萃取液5 mL，加入0.01 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液1 mL，充分搖勻。采用紫外分光光度計在400～800 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，詳見圖1。結(jié)果，兩種溶液均在620 nm波長處有最大吸收峰，故選擇620 nm作為檢測波長。

圖1 紫外掃描圖Fig 1 UV scanning spectra

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 顯色穩(wěn)定性考察 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行操作3次。按“2.2”項下酸性染料比色法“加入pH 4.5的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液……充分搖勻”步驟處理完畢后第0、5、10、15、20 min時測定吸光度。結(jié)果顯示，顯色反應(yīng)完畢5 min后吸光度值較不穩(wěn)定，因此供試品溶液需要在顯色反應(yīng)后5 min之內(nèi)測定。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項下對照品母液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于刻度試管中，以三氯甲烷稀釋至10 mL，制成石斛堿質(zhì)量濃度分別為4.16、6.24、8.32、10.40、12.48、14.56 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.2”項下酸性染料比色法進行顯色反應(yīng)。以三氯甲烷為空白溶劑對照，采用紫外分光光度計于620 nm波長處測定各樣品溶液的吸光度。以石斛堿質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標，得回歸方程為y＝0.051 4x+0.077（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，石斛堿質(zhì)量濃度在4.16～14.56μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行操作3次。供試品溶液在4℃下保存，并分別于3個不同工作日和每個工作日第0、4、8、12、24 h時，按“2.2”項下酸性染料比色法處理后測定，以外標法計算總生物堿含量，分別考察日間與日內(nèi)精密度。結(jié)果，3個工作日間總生物堿含量的RSD為3.93%（n＝3）；不同工作日當(dāng)天5個時間點總生物堿含量的RSD分別為4.52%、2.94%、3.84%（n＝5），表明該方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行操作6次。按“2.2”項下酸性染料比色法處理后測定，以外標法計算總生物堿含量。結(jié)果，總生物堿含量的RSD為0.97%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物4 g，分別加入1.452 6 mg/mL的石斛堿對照品濃溶液（按“2.1.1”項下對照品母液配制方法新配）1 mL后，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，平行操作6次。按“2.2”項下酸性染料比色法處理后測定，并以外標法計算總生物堿含量及加樣回收率。結(jié)果，樣品中總生物堿的平均加樣回收率為93.01%，RSD為1.97%（n＝6），表明該方法準確度良好，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

3 雙斛膠囊中總生物堿提取工藝的優(yōu)化

3.1 提取工藝的單因素考察

本研究以綜合評分法（以干膏得率和總生物堿含量計算）進行單因素考察。取按“2.1.2”項下方法多次加熱回流提取后合并的醇提液的上清液，倒入已在105℃下達到恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，90℃水浴蒸干，105℃烘箱放置3 h，再轉(zhuǎn)移到干燥器中放冷30 min，稱定質(zhì)量并計算干膏得率。設(shè)定總生物堿權(quán)重為7分、干膏得率權(quán)重為3分，合計10分，按公式計算綜合評分：綜合評分＝（總生物堿含量/總生物堿含量最大值）×7+（干膏得率/干膏得率最大值）×3。

3.1.1 浸泡時間 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定乙醇體積分數(shù)為80%、料液比為1∶8、提取時間為1 h、提取次數(shù)為1次，分別在不浸泡（0 h）和浸泡1、2、12、24 h后加熱回流提取。平行操作3次，依法測定干膏得率和總生物堿含量，并計算綜合評分，結(jié)果見圖2A。由圖2A可知，在浸泡時間0～12 h內(nèi)，隨著浸泡時間的增加，綜合評分不斷提高；當(dāng)浸泡時間為12～24 h時，綜合評分有所下降；其中以浸泡12 h時所得綜合評分最高。因此，本研究選擇浸泡時間為12 h。

圖2 單因素試驗結(jié)果Fig 2 Results of single factor tests

3.1.2 乙醇體積分數(shù) 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定浸泡時間為12 h、料液比為1∶8、提取時間為1 h、提取次數(shù)為1次，分別以體積分數(shù)為60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇進行回流提取。平行操作3次，依法測定干膏得率和總生物堿含量，并計算綜合評分，結(jié)果見圖2B。由圖2B可知，當(dāng)乙醇體積分數(shù)在60%～70%時，綜合評分較高；其中以乙醇體積分數(shù)為65%時，所得綜合評分最高。因此，本研究選擇乙醇體積分數(shù)60%～70%進行后續(xù)正交試驗。

3.1.3 料液比 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8g，固定浸泡時間為12 h、乙醇體積分數(shù)為65%、提取時間為1 h、提取次數(shù)為1次，分別以料液比1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15（g/mL）回流提取。平行操作3次，依法測定干膏得率和總生物堿含量，并計算綜合評分，結(jié)果見圖2C。由圖2C可知，當(dāng)料液比為1∶12～1∶13時，綜合評分呈迅速增長的趨勢；當(dāng)料液比降至1∶13之下時，綜合評分有下降的趨勢。雖然在料液比低于1∶14后綜合評分又有上升趨勢，但考慮溶劑量增加會給后續(xù)濃縮操作帶來諸多不便，且會造成試劑浪費等，因此綜合以上因素，本研究選擇料液比為1∶12～1∶14進行后續(xù)正交試驗。

3.1.4 提取時間 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定浸泡時間為12 h、乙醇體積分數(shù)為65%、料液比為1∶13、提取次數(shù)為1次，分別以不提取（0 min）和提取28、36、44、52 min進行回流提取。平行操作3次，依法測定干膏得率和總生物堿含量，并計算綜合評分，結(jié)果見圖2D。由圖2D可知，當(dāng)提取時間為28 min時，所得綜合評分已達最高值。考慮28 min已經(jīng)是較短時間，在后期放大研究中可能提取罐還未加熱就已經(jīng)到達考察的時間，所以沒有繼續(xù)對更短的提取時間進行比較，加之提取36、44 min時與提取28 min時所得結(jié)果很接近，因此綜合考慮，本研究選擇提取時間為28～44 min進行后續(xù)正交試驗。

3.1.5 提取次數(shù) 稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，固定浸泡時間為12 h、乙醇體積分數(shù)為65%、料液比為1∶13、提取時間為28 min，分別回流提取1、2、3、4次。平行操作3次，依法測定干膏得率和總生物堿含量，并計算綜合評分，結(jié)果見圖2E。由圖2E可知，隨著提取次數(shù)的增加（1～3次），綜合評分也相應(yīng)升高；當(dāng)提取第4次時，綜合評分下降，推測可能是長時間蒸發(fā)溶劑導(dǎo)致總生物堿成分受到破壞。因此，本研究選擇提取次數(shù)為1～3次進行正交試驗考察。

3.2 正交試驗優(yōu)化提取工藝

3.2.1 正交試驗考察 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為影響因素，以干膏得率和總生物堿含量的綜合評分為評價指標，進行醇提取工藝的L9（34）正交試驗，平行操作3次。因素和水平見表2，正交試驗設(shè)計和結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素和水平Tab 2 Factors and levels

由表3可知，各因素對綜合評分的影響大小依次為D＞B＞C＞A，最優(yōu)方案為A3B3C1D3。由表4可知，除D因素對工藝的影響有統(tǒng)計學(xué)意義外，其余因素的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義。綜合考慮提取效率和節(jié)約能源等因素，結(jié)合單因素考察結(jié)果，最終將醇提取工藝的最優(yōu)提取條件確定為A3B1C1D3，即浸泡12 h后，按乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶12（g/mL）提取28 min，共提取3次。

3.2.2 驗證試驗 稱取稱取金釵石斛和鐵皮石斛粗粉混合物8 g，混勻，按“3.2.1”項下最優(yōu)醇提取工藝條件進行提取并計算干膏得率和總生物堿含量，平行操作3次。結(jié)果，干膏平均得率為12.80%（RSD＝4.39%，n＝3），總生物堿平均含量為0.359 0 mg/g（RSD＝0.66%，n＝3），表明優(yōu)化工藝條件穩(wěn)定、可行。

表3 正交試驗設(shè)計和結(jié)果Tab 3 Design and results of orthogonal tests

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

4 討論

本研究采用經(jīng)典的酸性染料比色法測定總生物堿的含量，其原理為在適當(dāng)?shù)膒H條件下生物堿與氯離子結(jié)合生成陰離子，而陰離子與酸性染料中的陽離子定量結(jié)合成離子對，在一定波長處測定離子對的吸光度可用于間接反映生物堿含量[13]。由此可見，緩沖液的pH值和用量對試驗結(jié)果至關(guān)重要[14]。本研究參考文獻方法[15-17]，采用溴甲酚綠為酸性染料，以pH 4.5的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液5 mL調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值，然后在620 nm波長處測定產(chǎn)物離子對的吸光度；同時對顯色穩(wěn)定性進行考察，結(jié)果表明供試品溶液需要在顯色反應(yīng)后5 min之內(nèi)測定，以保證結(jié)果的準確性。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本研究所建方法簡便可行、靈敏度高，可用于雙斛膠囊提取物中總生物堿的含量測定。

生物堿是最早從石斛屬中分離得到的化學(xué)成分，其中金釵石斛已被證實為含有生物堿的種類最多、含量最高的品種，另外也有文獻報道鐵皮石斛中存在生物堿[8-9]。大量研究報道已經(jīng)證實，石斛生物堿類具有較強的藥理活性[18-21]。目前總生物堿的提取方法較多，主要包括采用有機溶劑加熱回流提取、酶法反應(yīng)、超聲提取、微波萃取等[22-24]。考慮到石斛藥材價格較高需避免浪費，而提取工藝越簡單則越易藥材損耗且成本較低，故本研究采用有機溶劑加熱回流提取，提取完成后可回收溶劑從而減少試劑損耗。甲醇和乙醇作為生物堿提取中最常見的有機溶劑，價廉易得，但甲醇毒性較大，故選擇乙醇作為總生物堿的提取溶劑[25]。

本課題組針對雙斛膠囊醇提取工藝進行研究，通過單因素試驗，初步確定浸泡時間、乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)對干膏得率和總生物堿含量的影響。前期實驗過程中發(fā)現(xiàn)，外界環(huán)境如天氣變化導(dǎo)致的溫濕度差異等對提取效果有一定干擾，因此為在較短的時間內(nèi)完成正交試驗考察，將浸泡時間固定為12 h，以減少環(huán)境變化的干擾，使實驗數(shù)據(jù)更準確可靠。在單因素考察的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)為因素進一步進行正交試驗篩選。結(jié)果顯示，各考察因素對綜合評分的影響強弱順序為提取次數(shù)＞提取時間＞料液比＞乙醇體積分數(shù)；各因素中以提取次數(shù)對綜合評分的影響最大，且僅該因素的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜合考慮因素顯著性以及時間、成本等，最終確定雙斛膠囊總生物堿的最佳醇提取工藝條件為固定浸泡12 h后，按乙醇體積分數(shù)為70%、料液比為1∶12（g/mL）提取28 min，共提取3次；驗證試驗結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定、可行。本研究可為雙斛膠囊的下一步開發(fā)奠定良好的工藝基礎(chǔ)。