復方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷定性篩查與定量測定方法的建立Δ

陳學艷，張敏娟，魏文芝（1.青海省藥品檢驗檢測院化學室，西寧810016；2.青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，西寧 810016）

復方龍膽碳酸氫鈉片是由碳酸氫鈉、大黃膏（粉）、龍膽膏（粉）、丁香油、薄荷油和適宜輔料組方而成的復方制劑，臨床主要用于治療胃脹、反酸、食欲不振等[1]。按照2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，該制劑組方中的大黃藥材應來源于蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）[2]，不含土大黃苷成分；而藏邊大黃（Rheum australe D.Don）、華北大黃（Rheum franzenbachii Munt）和波葉大黃（Rheum undulatum L.）等偽品中含有土大黃苷[3-4]。當前藥材市場上大黃品種混亂及質量不均一的問題較為嚴峻，尤其在大黃價格上升時，存在以廉價而幾乎無瀉下作用、服用后有腹痛副作用的藏邊大黃、華北大黃等摻假冒充的情況[5-6]。復方龍膽碳酸氫鈉片的現(xiàn)行質量標準為《國家藥品標準》WS-10001（HD-0351）-2002-2011，其中缺乏土大黃苷的檢查項。原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2010年5月5日批準發(fā)布藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目，要求對偽品大黃藥材中的土大黃苷進行檢查（批件號：2010001），但未規(guī)定復方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷的補充檢驗方法，也未見相關研究報道。為此，本課題組參考上述補充檢驗方法、2015年版《中國藥典》（一部）“大黃”品種項下的相關規(guī)定及相關文獻等，建立了復方龍膽碳酸氫鈉片中土大黃苷的檢測方法，旨在為控制該制劑原藥材的質量、確保該藥臨床使用的有效性和安全性提供技術支持。

1 材料

1.1 儀器

BS224S型萬分之一電子天平、CP225D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；e2695-2998型高效液相色譜（HPLC）儀（包括二極管陣列檢測器、四元泵一體機）、Acquity UPLC-TQD型液相色譜質譜聯(lián)用儀（包括三重四級桿質量分析器）均購自美國Waters公司；KQ-500DE型數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TLC Visualizer型薄層數碼成像儀（瑞士CAMAG公司）。

1.2 藥品與試劑

復方龍膽碳酸氫鈉片（從藥品流通領域抽樣獲取，分別來自編號為A、B、C、D、E、F、G、H的國內8家藥品生產企業(yè)，樣品信息詳見表1）；土大黃苷對照品[中國食品藥品檢定研究院，批號：110794-201708，供薄層色譜（TLC）和HPLC檢查用]；聚酰胺薄膜（臺州市路橋四甲生化塑料廠，供薄層層析用）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

表1 復方龍膽碳酸氫鈉片樣品信息Tab 1 Sample information of Compound gentian and sodium bicarbonate tablets

1.3 藥材

大黃藥材（本課題組自購，分別產自青海省大通縣、湟中縣、果洛藏族自治州，樣品批次編號：S1、S2、S3）經青海省藥品檢驗檢測院中藥室劉亞蓉主任中藥師鑒定為唐古特大黃（R.tanguticum Maxim.ex Balf.）的干燥根和根莖。

2 方法與結果

2.1 TLC法對土大黃苷的初步定性篩查

參考文獻[7]方法進行檢測。

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細，按制劑處方稱取約相當于大黃生藥100 mg的粉末，加甲醇10 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz，下同）處理20 min，濾過；取續(xù)濾液1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.1.2 陰性樣品溶液的制備 分別按本品各生產企業(yè)處方，制成缺大黃藥材的陰性樣品，再按“2.1.1”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.1.3 土大黃苷對照品溶液的制備 取土大黃苷對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含10 μg的溶液，即得（臨用新制）。

2.1.4 8家企業(yè)樣品的TLC抽檢及復檢 抽取8家企業(yè)生產的復方龍膽碳酸氫鈉片各20片（A企業(yè)樣品批號：20170717；B企業(yè)樣品批號：170602；C企業(yè)樣品批號：171213；D企業(yè)樣品批號：20170609；E企業(yè)樣品批號：20161012；F企業(yè)樣品批號：20180301；G企業(yè)樣品批號：20160902；H企業(yè)樣品批號：20170201），按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液。分別吸取上述供試品溶液、“2.1.2”項下陰性樣品溶液和“2.1.3”項下土大黃苷對照品溶液各5 μL，點樣于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸（30∶5∶5∶20∶0.1，V/V/V/V/V）為展開劑，展開；取出晾干，采用薄層數碼成像儀以紫外燈365nm波長進行檢視。結果，土大黃苷對照品溶液顯1個亮藍色熒光斑點；陰性樣品溶液在相應的位置處未見類似熒光斑點；供試品溶液（D企業(yè)產品，批號：20170609）在相應的位置處顯相同的亮藍色熒光斑點，其余7家企業(yè)產品的供試品溶液則均未見有類似熒光斑點。由此表明，陰性樣品對TLC檢測無干擾；抽檢的8家企業(yè)產復方龍膽碳酸氫鈉片樣品中僅D企業(yè)產品中有疑似非法成分土大黃苷檢出。8家生產企業(yè)抽檢樣品中土大黃苷的薄層色譜圖見圖1。

圖1 8家生產企業(yè)抽檢樣品中土大黃苷的薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatogram of rhaponiticin in spotchecking samples from 8 manufacturers

進一步對D企業(yè)生產的復方龍膽碳酸氫鈉片進行重點篩查，對該企業(yè)產10個批次樣品（批號見表1）同法進行TLC檢測。結果，各批次樣品的供試品溶液均在與土大黃苷對照品溶液相應的位置處顯相同的亮藍色熒光斑點。由此初步判定，D企業(yè)產樣品中含有非法成分土大黃苷。D企業(yè)樣品中土大黃苷的薄層色譜圖見圖2。

圖2 D企業(yè)產樣品中土大黃苷的薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of rhaponiticin from manufacturer D

2.2 HPLC法對土大黃苷的定性鑒定和含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：XSelectCSH C18（250 mm×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（20∶80，V/V）；檢測波長：328 nm（二極管陣列檢測器）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取約相當于大黃生藥100 mg的粉末，精密加入甲醇25 mL，精密稱定；超聲處理60 min，放冷，再次精密稱定，用甲醇補足減失的質量，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取“2.1.2”項下缺大黃藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 土大黃苷對照品溶液的制備 精密稱取土大黃苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.221 mg的對照品貯備液；精密吸取該貯備液5 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容，制成質量濃度為55.25 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.5 大黃藥材溶液的制備 取大黃藥材，粉碎并過4號篩，精密稱取藥材粉末0.2 g，按“2.2.2”項下方法制備大黃藥材溶液。

2.2.6 專屬性考察 取D企業(yè)產10個批次樣品（批號見表1），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別取上述供試品溶液、“2.2.3”項下陰性樣品溶液、“2.2.4”項下土大黃苷對照品溶液和“2.2.5”項下大黃藥材溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，10批次樣品均在約11.7 min處出現(xiàn)與土大黃苷對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰，詳見圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

為進一步確認與土大黃苷對照品溶液主峰保留時間一致的供試品溶液圖譜中主峰是否為土大黃苷成分，本課題組采用Empower 3色譜系統(tǒng)工作站對色譜峰進行了二極管陣列掃描紫外光譜提取。結果，二者的紫外光譜掃描圖相似度為99.9%，且均在219.0、324.6 nm波長處有較大吸收，由此可判定二者主峰為同一物質，即土大黃苷，詳見圖4。

圖4 二極管陣列掃描紫外光譜圖Fig 4 Diode array scanning ultraviolet spectrograms

結合圖3、圖4可見，供試品色譜圖中呈現(xiàn)與對照品色譜保留時間相同的色譜峰，并經紫外光譜提取后證實對應的是同一物質土大黃苷，且陰性樣品無干擾，由此表明所建方法專屬性良好。

2.2.7 線性關系考察 精密吸取“2.2.4”項下土大黃苷對照品貯備液適量，以甲醇稀釋制成質量濃度分別為0.884、8.84、22.1、44.2、88.4 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。以土大黃苷對照品質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、其峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。結果，回歸方程為y＝36 535.57x－27105.99（r＝0.999 9），表明土大黃苷質量濃度在0.884～88.4 μg/mL范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系。

2.2.8 檢測限與定量限 按“2.2.7”項下方法制備質量濃度為0.088 4 μg/mL的土大黃苷對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣5～10 μL測定，以信噪比3∶1測得土大黃苷進樣量檢測限為0.707 2 ng；同法制備質量濃度為0.176 8 μg/mL的土大黃苷對照品溶液，并同法分別進樣15～25 μL測定，以信噪比10∶1測得土大黃苷進樣量定量限為3.536 ng。

2.2.9 精密度試驗 精密吸取“2.2.4”項下質量濃度為55.25 μg/mL的土大黃苷對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，土大黃苷峰面積RSD為0.20%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（批號：20171007），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h 時，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，土大黃苷峰面積的RSD為0.73%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.11 重復性試驗 取D企業(yè)樣品（批號：20171007）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定并按標準曲線法計算含量。結果，土大黃苷平均含量為2.860 0 mg/g（RSD＝0.78%，n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.12 加樣回收率試驗 取已知含量的D企業(yè)樣品（批號：20171007，土大黃苷含量為2.860 0 mg/g）約0.3 g，平行操作6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入質量濃度為0.863 mg/mL的土大黃苷對照品溶液（按“2.2.4”項下制備方法新制）1 mL，再精密加入甲醇25mL，稱定質量；超聲處理60 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，濾過，即得。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，按標準曲線法計算土大黃苷含量，并計算回收率。結果，土大黃苷的平均回收率為96.55%（RSD＝0.53%，n＝6），表明本方法準確度良好，詳見表2。

表2 土大黃苷回收率試驗結果Tab 2 Results of recovery tests of rhaponiticin

2.2.13 耐用性試驗 采用不同品牌液相色譜儀（美國Waters公司e2695-2998型、日本Shimadzu公司LC-20AT型、美國Agilent公司1260 Infinity型）、不同品牌及型號的色譜柱（XSelectCSH C18柱、Waters SunFire C18柱、Thermo BDS Hypersil C18柱）分別進行相應測定，主峰與相鄰峰之間的分離度均可達到1.5以上，理論板數均大于6 000；連續(xù)測定結果RSD均小于2%，表明本方法耐用性良好。

2.2.14 各企業(yè)45批次樣品中土大黃苷的含量測定 精密稱取D企業(yè)產10批次樣品（批號見表1）適量，平行操作2份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定并計算含量，結果見表3。另取其余7家企業(yè)生產的35批次樣品（批號見表1）適量，平行操作2份，同法配制供試品溶液并測定，結果均未檢出土大黃苷峰，色譜圖見圖5。

表3 D企業(yè)產10批次樣品中土大黃苷的含量測定結果（n＝2，mg/g）Tab 3 Results of content determination of rhaponiticin in 10 batches of samples from manufacturer D（n＝2，mg/g）

2.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）對檢測結果的確證

圖5 A～C、E～H企業(yè)產35批次樣品高效液相色譜圖（疊加圖）Fig 5 HPLC chromatograms of 35 batches of samples from manufacturers A-C and E-H（overlayed maps）

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：乙腈（A）-0.01 mol/L醋酸銨溶液（B）[8]，梯度洗脫（0～4 min，90%A→70%A；4～9 min，70%A；9～11 min，70%A→90%A）；流速：0.35 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧質譜檢測器，負離子模式（ESI－）；檢測方式：選擇離子監(jiān)測（SIR），二級質譜掃描（Daughter scan）方式；去溶劑氣溫度：330℃；毛細管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：28 V；碰撞能量：42 eV；離子源溫度：110 ℃[9-10]。

2.3.3 供試品稀釋液的制備 取“2.2.2”項下供試品溶液，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.4 土大黃苷對照品稀釋液的制備 取“2.2.4”項下的質量濃度為55.25 μg/mL的土大黃苷對照品溶液，加甲醇稀釋得0.552 5 μg/mL對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.5 陰性溶液的制備 取“2.2.3”項下陰性樣品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.6 大黃藥材稀釋液的制備 取“2.2.5”項下大黃藥材溶液，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.7 樣品測定 精密吸取“2.3.3～2.3.6”項下各溶液，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜與質譜條件進樣測定。采用Masslynx 4.1軟件進行分析，記錄一級質譜圖與二級質譜圖。結果顯示，在土大黃苷對照品稀釋液中檢測到其準分子離子[M-H]－峰質荷比（m/z）為419.0；對m/z 419.0峰進行二級子離子掃描，產生的主要碎片離子m/z分別為257.1、241.2。同時，在供試品稀釋液中也檢測到m/z 419.0的準分子離子峰，對其進行二級子離子掃描質譜分析，同樣產生m/z分別為257.1、241.2的碎片離子峰，與土大黃苷對照品基本一致，詳見圖6。此外，陰性溶液和大黃藥材稀釋液經檢測均未產生與土大黃苷對照品一致的準分子離子（圖略），這進一步證實了正品大黃藥材中不含土大黃苷成分且陰性樣品對檢測無干擾。

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

圖6 土大黃苷質譜圖Fig 6 MS spectra of rhaponiticin

由于中成藥復方制劑成分復雜，若僅采用TLC法檢測某種成分是否存在，易產生假陽性結果。本研究對復方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷采用TLC法進行定性檢測，初步篩選出陽性樣品；進一步與土大黃苷對照品進行比對，通過HPLC法準確測定樣品中土大黃苷的含量；最后，采用UPLC-MS/MS法對檢出的土大黃苷的結構進行確證，以驗證前述HPLC法用于檢測制劑中土大黃苷含量的方法是否準確、可行。

3.2 TLC法條件篩選

本課題組前期考察了不同薄層板的分離效果，結果采用市售硅膠G板和聚酰胺薄膜均可有效分離供試品中的土大黃苷，但后者用于土大黃苷檢測的靈敏度更高且分離度更好：同一土大黃苷對照品溶液在硅膠G板上展開后呈現(xiàn)1個斑點，而在聚酰胺薄膜上除主斑點外尚可見其他2個斑點。此外，因土大黃苷對照品溶液不穩(wěn)定，長期放置主斑點易分解[11]，故對照品溶液需臨用新制。中藥制劑成分復雜，采用TLC法檢測時常會出現(xiàn)多個斑點，且在日光下、紫外光燈下檢視或通過氨蒸氣熏蒸后均呈現(xiàn)不同結果。本研究最終選擇在紫外光燈下辨識度較高、顯亮藍色熒光斑點的結果為檢視結果。

3.3 HPLC法樣品處理方法篩選

在供試品溶液制備時，本課題組參考文獻[12]方法，分別以甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑，考察了加熱回流0.5、1、2 h和超聲提取20、40、60 min等條件。結果，以甲醇為溶劑時土大黃苷提取較完全，且?guī)缀鯚o雜質干擾；加熱回流1 h與超聲處理1 h均可將樣品中的土大黃苷提取完全。考慮到操作的簡便可行，本研究選擇加甲醇超聲處理1 h進行提取。

3.4 UPLC-MS/MS法條件篩選

在進行UPLC-MS/MS分析時，由于供試品中成分復雜，分離效果不佳。本課題組將流動相洗脫條件由等度洗脫優(yōu)化為適宜的梯度洗脫條件，結果可提高各成分間的分離度；同時，考察了不同的離子化模式、毛細管電壓、錐孔電壓及碰撞能量等條件，結果在ESI－模式下，調節(jié)較低的錐孔電壓和適宜的碰撞能量，可獲得較佳的質譜信號。

3.5 8家企業(yè)抽樣的45批次樣品檢測結果分析

本研究采用HPLC法對從8家企業(yè)抽樣的45批次復方龍膽碳酸氫鈉片樣品中的土大黃苷進行了含量測定，結果有10個批次檢出了土大黃苷，檢出率達22%。這10批樣品均由D企業(yè)生產，說明該企業(yè)在生產復方龍膽碳酸氫鈉片時投料的大黃藥材存在以偽品替代正品的現(xiàn)象。因此，建立專屬性強、靈敏度高的檢測方法以控制復方龍膽碳酸氫鈉片乃至所有含大黃的中藥制劑中土大黃苷的含量，對于規(guī)范藥品生產、確保藥品質量很有必要。

綜上所述，本研究建立的TLC法定性初篩結合HPLC法定量測定復方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷的方法簡便、靈敏、可靠，現(xiàn)已申報國家藥品監(jiān)督管理局擬作為藥品補充檢驗方法實施；在實際檢驗中，如有必要可采用UPLC-MS/MS法進一步確證結果。