頂空氣相色譜法同時測定黃蜀葵花總黃酮提取物中9種有機溶劑的殘留量

張清華，張治云，楊海霞（山東省藥學科學院，濟南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵[Abelmoschus manihot（L.）]的干燥花冠，始載于宋代掌禹錫所著《嘉佑本草》，后歷代本草均有記載。《嘉佑本草》記載黃蜀葵花：“治諸惡瘡、膿水久不痤者，作末敷之即愈，為瘡家要藥”。《本草綱目》記載：“其主治小便淋及催生，消癰腫，浸油涂湯火傷”。現(xiàn)代藥理學研究證明，黃蜀葵花總黃酮具明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗病毒及促進愈合等藥理作用[1-4]，并可通過抑制心肌脂質(zhì)過氧化、抑制心肌炎癥反應，對缺血再灌注損傷的心肌細胞發(fā)揮保護作用[5]。

大孔吸附樹脂是一類具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附材料，已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域。大孔吸附樹脂多以苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯、丙烯腈等為原料制備，經(jīng)過其分離純化的中藥提取物及活性成分可能會引入苯、甲苯、氯苯、二甲苯等有機物，因此有必要進行相關(guān)殘留物檢測[6-10]。黃蜀葵花總黃酮是將黃蜀葵花藥材采用乙醇提取濃縮后，經(jīng)過大孔吸附樹脂進行純化，用不同比例的水/乙醇梯度洗脫，并將乙醇洗脫液濃縮干燥所得。在其制備過程中就采用了大孔吸附樹脂進行純化。因此，本研究參考國家標準文件（GB/T 24396-2009）[11]和 2015年版《中國藥典》（四部）附錄 0861[12]，以苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯為檢測指標，采用頂空氣相色譜法測定了黃蜀葵花總黃酮提取物中的大孔樹脂殘留物，以保證該中藥材提取物的質(zhì)量安全，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

6890N型氣相色譜儀，包括7694E型頂空進樣器、氫焰離子化（FID）檢測器（美國Agilent公司）；XS-205型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黃蜀葵花總黃酮提取物[本課題組自制，批號分別為20091212（初試樣品）和20170115、20170223、20170225（中試樣品）；所用藥材均產(chǎn)自江蘇徐州，每克提取物相當于生藥28.6 g]；苯（分析純）、1，2-二氯乙烷（色譜純）、二甲苯（色譜純）、苯乙烯（色譜純）、N-甲基吡咯烷酮（NMP，色譜純）均購自天津市科密歐化學試劑有限公司；丙烯腈（化學純）、氯苯（分析純）、二乙烯苯（化學純）、甲苯（色譜純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；苯乙醚（內(nèi)標，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲基丙烯酸甲酯（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：起始溫度32 ℃，保持6 min，以10℃/min的速率升溫至150℃，再以20℃/min的速率升溫至220℃，保持2 min；FID檢測器溫度：250℃；進樣口溫度：250℃；載氣為氮氣，流速：1.2 mL/min；分流比：10∶1；頂空進樣，頂空瓶體積：10 mL，頂空平衡溫度：90 ℃，平衡時間：45 min；進樣量：1 mL。

2.2 溶液制備

2.2.1 內(nèi)標溶液 精密稱取苯乙醚100.27 mg，置于50mL量瓶中（事先已加入適量NMP），再加NMP稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.5 mL，置于25 mL量瓶中，加10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標貯備液。精密量取該貯備液適量，加10%NMP水溶液稀釋制成苯乙醚質(zhì)量濃度約為4 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 對照品溶液 （1）精密稱取苯10.13 mg、1，2-二氯乙烷10.12 mg、丙烯腈50.27 mg、氯苯50.89 mg、二乙烯苯50.23 mg、甲基丙烯酸甲酯100.75 mg、甲苯100.96 mg、二甲苯100.09 mg、苯乙烯100.26 mg，置于同一50 mL量瓶（事先已加入適量NMP），以NMP稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.5 mL，置于25 mL量瓶中，加10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液Ⅰ。（2）分別精密量取對照品貯備液Ⅰ和“2.2.1”項下內(nèi)標貯備液適量，加10%NMP水溶液稀釋制成含苯、1，2-二氯乙烷分別約為0.4 μg/mL，含丙烯腈、氯苯、二乙烯苯分別約為 2 μg/mL，含甲基丙烯酸甲酯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、苯乙醚（內(nèi)標）分別約為4 μg/mL的混合溶液，作為對照品貯備液Ⅱ。（3）取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，精密稱定，置于10 mL頂空瓶中，精密加入對照品貯備液Ⅱ2.0 mL，密封，超聲（功率：50 W，頻率：40 kHz，下同）處理2 min使溶解，輕輕搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，精密稱定，置于10 mL頂空瓶中，精密加入10%NMP水溶液2.0 mL，密封，超聲處理2 min使溶解，輕輕搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取空白溶劑（10%NMP水溶液）和對照品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，對照品溶液中各待測成分出峰順序依次為苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯（呈現(xiàn)四峰）、氯苯、苯乙烯、苯乙醚、二乙烯苯（呈現(xiàn)四峰），且各待測峰之間的分離度均大于1.5；空白溶劑對上述成分檢測無干擾。色譜圖詳見圖1。

圖1 對照品溶液和空白溶劑氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms of control solution and blank solvent solution

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項下對照品貯備液Ⅰ0.2、0.3、0.5、1.0、1.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，均精密加入“2.2.1”項下內(nèi)標貯備液0.5 mL，以10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，制得線性系列對照品溶液（編號分別為①②③④⑤）。精密稱取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，置于10mL頂空瓶中，平行操作5份，分別精密加入上述線性系列對照品溶液2 mL，密封，超聲使溶解，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。另同步制備不加對照品貯備液、只加提取物樣品0.4 g的頂空瓶作為基質(zhì)樣品，同法測定（以下同）。以對照品溶液中待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、對照品溶液中各被測成分峰面積（需扣除基質(zhì)樣品中對應成分的峰面積，以下同；二甲苯、二乙烯苯均按其4個峰的峰面積之和計算）與內(nèi)標峰面積的比值（y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系試驗結(jié)果Tab 1 Results of linear relationship test

2.5 定量限和檢測限考察

精密量取“2.4”項下③號線性對照品溶液，以10%NMP水溶液進行適當稀釋后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。按信噪比10∶1考察定量限，結(jié)果苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯的定量限分別為0.162 08、0.201 08、0.080 6、0.080 768、0.161 92、0.400 36、0.040 712、0.026 736、0.013 395 μg/mL；按信噪比3∶1考察檢測限，結(jié)果上述待測成分的檢測限分別為0.040 52、0.040 216、0.026 87、0.026 9、0.040 48、0.080 072、0.013 57、0.008 912、0.004 465 μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.2”項下對照品貯備液Ⅰ0.5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項下內(nèi)標貯備液0.5 mL，以10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液Ⅲ；精密稱取黃蜀葵花總黃酮提取物0.4 g，置于10 mL頂空瓶中，平行操作5份，分別精密加入貯備液Ⅲ2.0 mL，密封，超聲使溶解，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD分別為0.80%、2.98%、1.63%、2.60%、2.69%、4.92%、2.56%、2.88%、4.42%（n＝5），表明儀器連續(xù)進樣精密度良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取黃蜀葵花總黃酮提取物（批號：20091212）0.4 g，置于10 mL頂空瓶中，共6份，分別精密加入“2.2.1”項下內(nèi)標溶液2.0 mL，密封，超聲使溶解，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按內(nèi)標法計算各待測成分含量。結(jié)果，樣品中甲基丙烯酸甲酯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯平均含量分別為0.000 032%、0.000 015%、0.000 009%、0.000 053%（RSD分別為3.95%、2.84%、3.42%、2.51%，n＝6），而苯、丙烯腈、甲苯、1，2-二氯乙烷、氯苯則均未檢出。

2.8 回收率試驗

精密量取“2.2.2”項下對照品貯備液Ⅰ0.4、0.5、0.6 mL，置于25 mL量瓶中，分別精密加入“2.2.1”項下內(nèi)標貯備液0.5 mL，以10%NMP水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為80%、100%、120%回收對照品溶液。取9支10 mL頂空瓶（編號為1～9），分別加入已測得各組分含量的黃蜀葵花總黃酮提取物（批號：20091212）0.4 g；1～3號頂空瓶均分別加入80%回收對照品溶液2 mL，4～6號頂空瓶均分別加入100%回收對照品溶液2 mL，7～9號頂空瓶均分別加入120%回收對照品溶液2 mL，超聲使溶解，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按內(nèi)標法計算苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯的含量，并計算回收率。結(jié)果，上述待測成分的平均回收率分別為101.76%、99.41%、99.71%、104.12%、111.27%、105.70%、102.95%、102.61%、101.72%（RSD分別為2.88%、3.27%、1.21%、3.57%、8.16%、5.37%、2.97%、3.09%、4.50%，n＝9），表明本方法準確度良好。

2.9 黃蜀葵花總黃酮提取物樣品中殘留溶劑含量測定

取3批黃蜀葵花總黃酮提取物中試樣品（批號：20170115、20170223、20170225）適量，按“2.2.3”項下方法處理后，再按“2.7”項下方法測定9種殘留溶劑含量。結(jié)果，3批樣品中均未檢出上述殘留溶劑。

3 討論

黃蜀葵花總黃酮提取物在水中的溶解性較差，本研究采用10%NMP水溶液為溶劑，可較好地溶解樣品。筆者曾在預試驗中嘗試采用二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、水、NMP、10%NMP水溶液溶解提取物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水不能完全溶解提取物，而二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺均會對被測組分產(chǎn)生干擾；NMP雖能較好地溶解提取物，但會導致苯和1，2-二氯乙烷的響應值偏低，不能滿足檢測需求；采用10%NMP水溶液作為溶劑時，不僅能較好地溶解提取物，對各被測組分也無干擾，而且苯和1，2-二氯乙烷的響應值明顯提高。

本課題組采用頂空氣相色譜法同時測定黃蜀葵花總黃酮提取物中的苯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、1，2-二氯乙烷、二甲苯、氯苯、苯乙烯、二乙烯苯等9種有機溶劑的含量。經(jīng)前期優(yōu)化色譜條件后，采用程序升溫法能實現(xiàn)各待測成分的良好分離。其中，二甲苯、二乙烯苯均為其鄰、間、對二甲苯/二乙烯苯等異構(gòu)體的混合物[12]，導致色譜圖上均呈現(xiàn)四峰現(xiàn)象，故均以4個峰的峰面積之和計算對應成分總峰面積。

在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，采用頂空進樣法時，供試樣品的基質(zhì)效應對回收率試驗結(jié)果影響較大，如果不在對照品溶液中加入黃蜀葵花總黃酮提取物，則所得各待測組分回收率明顯偏低。為了消除基質(zhì)效應的影響，本課題組采用標準加入法[12]進行回收率試驗，在對照品溶液中加入與樣品溶液相同量的黃蜀葵花總黃酮提取物，使對照品和供試樣品處于相同的基質(zhì)環(huán)境下，結(jié)果顯示，各待測組分回收率均良好，符合相關(guān)規(guī)定。

綜上所述，本方法簡便、準確、穩(wěn)定、可靠，可用于黃蜀葵花總黃酮提取物中9種有機溶劑殘留量的測定。