YKL-40 RNA 干擾對載脂蛋白E 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

張輝 周文平 劉剛瓊 張文靜 張金盈

1鄭州大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科（鄭州450052）；2鄭州大學第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科（鄭州450052）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）進程中存在YKL-40 高表達［1］。本研究探討YKL-40 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）對載脂蛋白E 基因敲除小鼠（apolipoprotein E-deficient mice，apoE-/-小鼠）頸動脈AS 斑塊的影響。

1 材料與方法

1.1 材料YKL-40 shRNA慢病毒載體目的基因序列為：5′-GCTCCAGTGCTGCTCTGCATA-3′。12 周齡雄性apoE-/-小鼠72 只，購自北京大學醫(yī)學部，均采用高脂喂養(yǎng)。Trizol 試劑購自美國GIBCO 公司；油紅O、單核細胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）及脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprotein associated phospholipase A2，Lp-PLA2）等ELISA 試劑盒購自鄭州森斯科貿(mào)生物制品有限公司。所有動物實驗均經(jīng)鄭州大學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠AS 模型的建立及動物分組本研究采用左頸總動脈縮窄性套管法誘導AS 形成并建立apoE-/-小鼠AS 模型［2-3］：麻醉滿意后apoE-/-小鼠頸正中切口，分離左頸總動脈，在動脈上套扎長3 mm 內(nèi)徑0.3 mm 的硅膠套管并固定［2-3］，術(shù)后縫合切口，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。8 周后apoE-/-小鼠隨機分為對照組（n = 24），病毒陰性對照（negative control，NC，n = 24）組和觀察組（n = 24），再次分離左頸總動脈，去除硅膠套管并分別局部滴注生理鹽水、陰性對照病毒（5 × 107TU）、YKL-40 RNA 干擾慢病毒（5×107TU）。6 周后收集斑塊制作6 μm冰凍切片采用HE 和油紅O 染色并進行病理組織學分析。

1.2.2 血漿MCP-1、Lp-PLA2及血脂水平測定小鼠麻醉后取血，離心后取上層血漿檢測，測定Lp-PLA2、MCP-1、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）及總膽固醇（total cholesterol，TC）、水平。

1.2.3 組織形態(tài)學檢測使用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件對HE 染色及油紅O 染色切片進行定量分析，檢測斑塊面積、纖維帽厚度及脂質(zhì)含量。

1.3 統(tǒng)計學方法本研究采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所有計量資料以均數(shù)± 標準差表示，正態(tài)性檢驗后進行單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗，P ＜0.05認為差異有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 各組間體質(zhì)量和LDL-C、HDL-C、TC 及TG水平比較對照組、NC 組與觀察組小鼠相比，體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且沒有小鼠在慢病毒轉(zhuǎn)染后死亡，說明本實驗以及慢病毒轉(zhuǎn)染是安全的。另外，各組間LDL-C、HDL-C、TC 及TG 水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05，表1）。

2.2 YKL-40 RNAi 對AS 斑塊形態(tài)及組分的影響對照組、NC 組與觀察組小鼠AS 斑塊纖維帽厚度分別為（9.14 ± 0.84）、（9.22 ± 0.91）、（13.15 ±1.21）μm，觀察組斑塊纖維帽厚度明顯高于對照組和NC組（P ＜0.05）。對照組、NC組與觀察組斑塊面積分別為（6.21 × 104）、（6.17 × 104）、（4.76 ×104）μm2，觀察組斑塊面積明顯低于對照組和NC 組（P ＜0.05）。對照組、NC 組與觀察組斑塊脂質(zhì)含量分別為30.14%、29.73%、22.95%，觀察組斑塊脂質(zhì)含量明顯低于對照組和NC 組（P ＜0.05，圖1）。對照組與NC 組相比脂質(zhì)含量、纖維帽厚度及斑塊面積均無顯著性差異，這表明觀察組得出的有益作用并非由病毒侵染所導致的非特異性免疫應答所引起，進一步證實了RNAi 的干擾有效。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平Tab.1 Body weight and plasma lipid levels among all groups ±s

表1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平Tab.1 Body weight and plasma lipid levels among all groups ±s

注：組間比較采用方差分析，*P＞0.05

體質(zhì)量（g）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）對照組28.44±3.73 29.11±4.68 3.05±0.52 25.74±2.58 2.69±0.82 NC 組29.32±3.71*29.85±4.97*3.23±0.51*25.22±2.44*2.62±0.79*觀察組29.15±3.66*30.32±4.56*3.17±0.58*25.50±2.51*2.65±0.88*

2.3 YKL-40 RNAi 對血漿炎癥因子Lp-PLA2及MCP-1 水平的影響與對照組和NC 組小鼠相比，觀察組血漿炎癥因子Lp-PLA2及MCP-1 水平明顯降低，這說明YKL-40 RNAi 治療可降低炎癥因子Lp-PLA2及MCP-1 的水平（P ＜0.05）；另外對照組與NC 組相比，Lp-PLA2及MCP-1 水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組組炎癥因子水平Tab.2 The expression of inflammatory cytokines in the each group ±s

表2 各組組炎癥因子水平Tab.2 The expression of inflammatory cytokines in the each group ±s

注：組間方差分析，*P ＜0.05；與對照組相比，▲P ＞0.05

Lp-PLA2（μg/L）MCP-1（μg/L）對照組131.28±14.55 13.56±1.38 NC 組133.68±14.21▲13.99±1.43▲觀察組79.88±9.26*8.62±0.95*

3 討論

AS 是一個復雜的的病理生理學進程，在冠心病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。目前普遍認為AS 是一種炎癥性疾病［3-4］，YKL-40是一種新的AS 危險因子和炎癥的標記物，可由斑塊局部活化的巨噬細胞、血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞分泌［5-7］。AS 進程中存在YKL-40 高表達，YKL-40 在AS 的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)YKL-40 與內(nèi)皮功能紊亂及斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)［9］。YKL-40 在炎癥、細胞外基質(zhì)重構(gòu)、細胞增殖及血管發(fā)生中發(fā)揮重要作用［8］。研究［8-9］顯示，YKL-40 水平升高與冠狀動脈及腦血管事件的發(fā)生相關(guān)，且YKL-40 水平增加與冠狀動脈病變進展相關(guān)。

圖1 對照組、NC 組與觀察組的斑塊形態(tài)學分析Fig.1 Plaque morphology of the control，NC and treatment groups

抑制AS 炎癥因子及基因治療是未來治療AS的新途徑［2］。已證實RNA 干擾可以高效特異性地抑制靶基因的表達［3］。慢病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高，持續(xù)時間長，安全、有效等特點［3］。本研究首先構(gòu)建apoE-/-小鼠AS 模型，然后合成針對YKL-40的慢病毒載體并對apoE-/-小鼠頸動脈斑塊進行慢病毒轉(zhuǎn)染，降低YKL-40 的表達，觀察YKL-40 RNA干擾對病變局部脂質(zhì)含量、纖維帽厚度以及斑塊面積的影響，并進一步觀察Lp-PLA2以及MCP-1 等炎癥基因表達水平的變化。

本研究表明，YKL-40 RNA 干擾可以降低apoE-/-小鼠促炎因子Lp-PLA2及MCP-1 的水平，降低斑塊脂質(zhì)含量，減少斑塊面積并增加纖維帽厚度，這說明YKL-40 RNA 干擾后AS 斑塊穩(wěn)定性升高。研究［10］表明不穩(wěn)定斑塊是主要心血管事件及腦卒事件發(fā)生的主要原因。本研究表明，YKL-40 RNA 干擾可以降低炎癥基因的表達，增高斑塊纖維帽厚度，降低斑塊脂質(zhì)含量，小鼠頸動脈斑塊穩(wěn)定性升高，易損性降低，進一步證實了YKL-40 RNA 干擾治療AS 的有效性。

炎癥反應在AS 的發(fā)生發(fā)展以及斑塊失穩(wěn)定和破裂過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Lp-PLA2及MCP-1是AS 進程中重要的炎癥因子，Lp-PLA2可水解氧化磷脂生成溶血磷脂膽堿和氧化非酯化脂肪酸［11］，這些水解產(chǎn)物都具有強大的促炎作用和致AS 作用，可促進引起單核細胞聚集、內(nèi)皮功能紊亂并促進動脈管壁以及斑塊局部慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展［12-13］。故Lp-PLA2是可導致斑塊失穩(wěn)定，斑塊破裂和臨床心腦血管事件的發(fā)生［14-15］。MCP-1 可促進單核巨噬細胞在AS 斑塊部位聚集，并介導對單核細胞及炎癥細胞的遷移和活化。因此，本研究結(jié)果進一步表明，YKL-40 RNA 干擾通過降低Lp-PLA2 及MCP-1 等炎癥因子的水平，降低斑塊脂質(zhì)含量并降低斑塊易損性。

此外，筆者排除了本研究的有益結(jié)果來自于病毒非特異性免疫反應的可能性，因為對照組與NC 組相比，各參數(shù)間均無統(tǒng)計學差異。AS 過程中YKL-40 等炎癥因子表達增加。抑制AS 的炎癥因子是未來治療AS 的新途徑［2，15］。因此，慢病毒介導的YKL-40 RNA 干擾提供了一種安全，有效的治療AS 的方法。

本研究結(jié)果表明，YKL-40 RNA 干擾可降低小鼠YKL-40 水平，進而降低Lp-PLA2及MCP-1 等炎癥因子水平，進而降低斑塊脂質(zhì)含量并降低斑塊易損性，這些有益作用是獨立于降脂作用之外的。因此，慢病毒介導的YKL-40 RNA 干擾提供了一個治療AS 的新途徑。