鼠腦膠質瘤瘤周水腫組織磁共振灌注成像參數與水通道蛋白-1 的相關性

袁園 李香營 談順 陳建強 楊光 陳晶

中南大學湘雅海口醫院（海口市人民醫院）1放射科，2中心實驗室，3病理科（海口570208）

膠質瘤是顱內最常見的原發性惡性腫瘤，血管新生是其生長的先決條件，并對腫瘤細胞的浸潤和轉移起著非常重要的作用［1］，研究顯示膠質瘤瘤體與瘤周組織新生血管活性不同，瘤周新生血管較腫瘤內部的血管活性更高，這為進一步研究腫瘤的生物學特性明確了方向［2］。磁共振灌注成像（perfusion weighted imaging，PWI）是一種功能磁共振成像技術，其優勢在于通過灌注成像參數間接反映腫瘤新生血管數量和質量（血管完整性和微血管通透性等），尤其是近幾年已然成為分子影像研究腫瘤血流動力學的重要工具［3-5］。水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）是能夠實現跨膜轉運水分子的膜蛋白家族成員之一，其作用通過分泌血管內皮生長因子（VEGF）促進血管內皮細胞的遷徙移動，進而提高新生腫瘤血管的數量，不過這些新生血管完整性不高，通透性較高。因而研究AQP-1 在膠質瘤瘤周血管新生中表達與局部腦血容量（regional cerebral blood volume，rCBV）、表面血管通透性（permeability surface，PS）的相關性是可行的，并具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和模型制作雌性Wistar大鼠39只，體質量240～325 g，經過適應性飼養后按照隨機數字表的方法分成實驗組（n = 34 只）和對照組（n=5只）。C6膠質瘤細胞株按照以下具體步驟培養，首先配置細胞生長所需的完全培養基（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液），然后常規傳代，培養并通過臺盼藍排斥試驗檢驗C6 膠質瘤細胞的活性，保證細胞活力＞95%，最后計數培養的C6 膠質瘤細胞，要求接種細胞數不低于1 ×106/10 μL。以40 mg/kg 劑量用1%戊巴比妥鈉對大鼠行腹腔注射麻醉，俯臥位頭部固定于單臂數顯腦立體定位儀上，頭頂去毛，消毒，切開頭皮，用微型手持式顱鉆在冠狀縫前1 mm，矢狀縫右旁開3 mm處鉆一骨孔。接種專用10 μL微量注射器將1×106個細胞完全注入硬腦膜下5 mm 處（進硬腦膜下6 mm，退1 mm），注射速率為1 μL/min，注射完畢后靜止10 min 后緩慢速退出微量注射器，封閉骨孔，觀察接種大鼠生命體征并采用單籠飼養，對照組采用相同的接種方法操作，注射完全培養基［6］。

1.2 MRI 掃描

1.2.1 MRI 掃描技術采用美國通用公司生產的超高場強3.0 T MRI 掃描，線圈為上海晨光公司提供的專用四通道大鼠線圈。所有荷瘤大鼠和對照組大鼠于接種后3～4 周行常規MRI 檢查。T1WI TR/TE = 350 ms/19 ms，T2WI TR/TE = 3 000 ms/120 ms，層厚= 3.0 mm，層間距= 0 mm，矩陣192 ×192，FOV = 8 cm × 8 cm。T2 Flair 采用Propeller 技術，具體參數為TR/TE=9 000 ms/155 ms，NEX=1，層厚=3.0 mm，FOV=15 cm×15 cm。

PWI 采用GRE-EPI 序列，TR/TE = 1 000 ms/25 ms，層厚= 3 mm。層間距= 0 mm，FOV = 8 cm× 8 cm，矩陣64 × 96，FA = 10°NEX = 1，定層面獲取3 基本圖像后經尾靜脈注入0.2 mmol/kg 釓噴酸葡胺（Gd-DTPA），注射時＜2 s，采用多層采集方式，每層面共獲取50 幅圖像。之后行增強T1WI 和T1-3D-Bravo檢查，T1-3D-Bravo參數：層厚=0.8 mm，矩陣256 × 256，pre time = 380 ms，FA = 15°，FOV =8 cm×8 cm。

1.2.2 MRI 圖像及數據處理利用Function Tool 4.0 工作站對原始圖像進行后處理，在經驗豐富的神經外科專家和神經影像專家指導下，選取多個等大ROI 取最大血容量作為相應部位的rCBV 值，PS值計算參考國內學者錢銀鋒等［7］的方法。ROI選擇要去除腦脊液、腦室等影響結果的非腦組織。通過T2WI+T2 FLAIR+T1WI增強+T1-3D-bravo容積增強四個掃描序列確定瘤體與瘤周水腫組織。

1.3 病理檢查荷瘤大鼠和對照組大鼠在接受MRI 掃描后，采用4%的多聚甲醛灌注固定全腦。以視交叉為參照，將瘤周水腫組織進行切片，制成與PWI 層面位置一致的0.4 μm 厚玻片，HE 染色，光鏡下觀察接種膠質瘤的WHHO 級別和瘤體邊界情況。按照公司提供的說明書進行GFAP、S-100β 和AQP-1 的鏈霉素抗生物素蛋白一過化物法。AQP-1 以大鼠腎臟標本做陽性對照。AQP-1結果判定參照李香營等［8］方法，計算400 倍光鏡下AQP -1 累積光密度（integrated optical density，IOD），以反映每個視野的陽性細胞免疫染色強度，并計算每只荷瘤大鼠5 張切片5 個視野下的平均IOD 值。

1.4 統計學方法本實驗結果均為計量資料，以均值±標準誤表示，采用統計軟件SPSS 17.0 中的兩獨立樣本t 檢驗分析灌注參數（rCBV 值和PS 值）在瘤周組織和對側腦組織的差別。AQP-1 在瘤周水腫組織中表達的IOD 值與rCBV 值和PS 值的相關性采用Pearson 相關分析法進行檢驗，得出兩者的相關系數并進行t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MRI 檢查結果本組實驗接種的C6 膠質瘤大鼠模型均于3～4 周完成MRI 掃描。此階段膠質瘤瘤體信號不均勻，T1WI 呈等或稍低信號，T2WI 和T2 flair 以高信號為主，注射對比劑后膠質瘤多呈環形強化或均勻強化，瘤周水腫則呈現長T1 長T2 信號，注射對比劑后無強化。對照組大鼠腦實質MRI 各序列均未發現異常。荷瘤大鼠瘤周水腫組織rCBV 值和PS 值均較正常側腦組織升高，且差異具有統計學意義（P ＜0.05），見表1 及圖1。

表1 瘤周水腫組織和正常側腦組織rCBV 值和PS 值比較結果Tab.1 Comparison of rCBV value and PS value between peritumoral edema tissue and contralateral brain tissue ±s

表1 瘤周水腫組織和正常側腦組織rCBV 值和PS 值比較結果Tab.1 Comparison of rCBV value and PS value between peritumoral edema tissue and contralateral brain tissue ±s

部位指標rCBV PS瘤周244.34±45.96 1.32±0.13對側205.18±30.46 0.35±0.05 t 值4.02 38.69 P 值＜0.05＜0.05

2.2 病理結果所有細胞接種后成活大鼠經病理證實均有瘤體形成，瘤周水腫組織結構疏松，部分細胞胞漿空泡變，細胞間隔增寬，間質疏松水腫，散在不同程度的腫瘤細胞浸潤。AQP-1 抗體免疫組化染色部位在異常星形細胞包膜、胞漿及血管內皮細胞中表達，瘤周水腫組織AQP-1 表達的IOD值為（76 595.35 ± 9 291.12）。Pearson 相關分析顯示，瘤周水腫組織rCBV 值和PS 值分別與AQP-1 陽性表達IOD 值間均存在正相關（r1=0.51，r2=0.49，P ＜0.05）。見圖2、3。

圖2 HE 染色示瘤周腦組織神經元數量減少（HE，×200）Fig.2 HE staining showed that the number of neurons in the peritumoral brain tissue decreased（HE，×200）

圖3 免疫組化示瘤周浸潤的腫瘤細胞和內皮細胞AQP-1表達陽性（SP，×200）Fig.3 Immunohistochemistry showed positive expression of AQP-1 in tumor cells and endothelial cells in peritoneal infiltration of tissue（SP，×200）

3 討論

膠質瘤作為顱內最常見的原發性惡性腫瘤，其生長依靠充足的血流供應，一旦這先決條件得到滿足，腫瘤細胞的浸潤和轉移也得以觸發。可以說在沒有血管供應的階段，腫瘤細胞生長的直徑多不會超過2 mm，而一旦擁有豐富血管新生，就可以使腫瘤細胞依靠足夠的血供和營養促進自身生長和遷徙、移動。新生血管結構具有結構不完整，成熟度不高，比正常成熟血管具有更高的通透性。PWI 利用分析檢測含對比劑的血液首次通過瘤體及瘤周新生血管時隨時間變化的組織信號強度，計算出感興趣區rCBV 及PS 值等血流動力學參數。其中rCBV 值代表組織血容量，與微血管密度（microvessel density，MVD）成正比，代表新生血管的豐富程度，PS值也可用來反映新生血管生成的速率［9］，二者聯合可較全面的反映腫瘤新生血管的情況，對了解腫瘤的生物學特性提供了客觀依據。

本研究選擇的時間節點為C6 膠質瘤細胞接種后3～4 周，此階段腫瘤級別多較高，瘤周水腫明顯，腫瘤浸潤性顯著，適合評估膠質瘤新生血管情況。研究顯示在膠質瘤生長階段晚期，其血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）多有破壞，通透性增高，在首次團注對比劑后，會出現對比劑通過不完整的BBB 滲透到細胞外間隙的現象，這一結果會通過改變血管內外對比劑濃度梯度差異引起組織信號弛豫效應增高，隨之信號降低程度縮小，獲得的灌注參數rCBV 值偏低［10］。考慮到3～4 周的C6腦膠質瘤新生血管非常豐富，各種管徑的新生血管均存在，SE-EPI 序列僅對正常毛細血管灌注敏感，容易低估此階段膠質瘤灌注情況，本研究首選GRE-EPI 序列作為磁共振灌注成像的掃描序列，這和國外研究結果［10］相似。同樣為了提高膠質瘤瘤體和瘤周組織界定的準確性，本研究參照國內文獻［8］除包括T2WI 和T1WI 增強序列，還額外增加T2-Flair 和T1-3D-Bravo 容積增強掃描，以期三維立體、動態化界定膠質瘤瘤體、瘤周組織并全面評估感興趣區的內部結構，達到精準定位。在細胞接種后3～4 周后，瘤周水腫組織織rCBV 值和PS值均較正常側腦組織升高，且差異有統計學意義。這一觀點也得到國外學者WEBER 等［11］支持，其團隊在研究單發轉移瘤瘤周水腫和高級別膠質瘤瘤周水腫的差異時發現，灌注參數之間存在距離差異，尤其是高級別膠質瘤瘤周水腫區的灌注參數較正常側腦組織明顯升高，即近膠質瘤瘤體邊緣的瘤周組織的灌注參數rCBV 值較遠離瘤體邊緣的區域的灌注參數rCBV 值明顯升高。而VEERAVAGU 等［12］通過建立小鼠（GL26）膠質母細胞瘤模型研究PWI 在其新生血管評估中的應用價值時認為，腫瘤血管的通透性與VEGF 和新生血管密度存在一定的相關性，從理論上講，膠質瘤生長處于血管形成期時，因惡性程度高，需要豐富的血流供應，而這些新生血管發育不成熟，結構不完整，管壁薄、管徑小，因此血管通透性也就越高，反映了膠質瘤新生血管在生物學特性上的一致性。本文所有接種大鼠瘤周組織內，在光鏡下均可發現分化程度不同的新生血管及浸潤的膠質瘤細胞，新生血管可促進腫瘤細胞浸潤，而浸潤的腫瘤細胞也會加速腫瘤血管的新生，二者存在相互促進作用。在一定程度上可以說膠質瘤新生血管的數量和不成熟性與瘤周水腫組織血容量和血管通透性成正相關。

AQP-1 主要表達在膠質瘤星形細胞和血管內皮細胞的細胞膜上表達，且膠質瘤級別越高，AQP-1表達越明顯。研究顯示AQP-1具有多種功能，除了跨膜轉運水分子之外，還通過Lin7/beta-catenin 介導的細胞轉運機制促進內皮細胞遷移［13］。可以說，血管內皮細胞的遷移在膠質瘤新生血管形成過程中至關重要。其中，VEGF 作為血管生成過程中最關鍵的刺激因子，能與內皮細胞受體特異性結合直接刺激血管內皮細胞增殖，促進內皮細胞遷移，誘發新生血管形成，這種機制形成的腫瘤血管內皮細胞不完整，通透性增加［14］。磁共振灌注參數rCBV值和PS 值能夠準確反映膠質瘤瘤體及瘤周水腫組織血流動力學方面的信息，而AQP-1具有通過分泌VEGF 促進血管內皮細胞遷移的功能，不僅有助于增加新生腫瘤血管的數量，而且改變了新生血管的功能。本研究中接種的C6膠質瘤大鼠模型在3～4周后接受PWI 掃描，發現瘤周水腫組織AQP-1陽性表達IOD 值與rCBV 值和PS 值均存在正相關。因此可以利用灌注參數rCBV 值和PS 值反映瘤周水腫組織中AQP1 的表達水平，以實現用可視化的影像學表現反映在分子水平發生的不可見的變化，類似于國內學者通過磁共振彌散張量成像參數各項異性分數（fractional anisotropy，FA）間接反映膠質瘤瘤周水腫組織AQP-1的表達水平［15］。

總之，AQP-1 具有促內皮細胞增殖的作用，能夠刺激VEGF 分泌，參與并加速血管內皮細胞遷移，在增加膠質瘤新生血管數量和提高血管通透性方面具有重要作用；PWI 憑借多種灌注參數值（rCBV 與PS 值）可全面準確的反映膠質瘤新生血管的量和質的情況，因此研究膠質瘤瘤周組織AQP1 陽性表達與灌注參數（rCVB 和PS 值）的相關性是可行的，且有重要的臨床意義。本研究結果認為3～4 周大鼠移植C6 膠質瘤瘤周水腫組織灌注參數rCBV 值和PS 值均較正常側腦組織升高，并可以體現瘤周水腫組織AQP-1 的陽性表達水平，這有助于將不可見的分子水平的變化轉變成可見的影像學表現并加以量化。