痤瘡型多囊卵巢綜合征患者腸道菌群分析

陳方元 賴志文 徐祖森

自貢市婦幼保健院1皮膚科，2生殖健康與不孕科（四川自貢643000）；3華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院（武漢430030）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見的內分泌和代謝性疾病，痤瘡、黑棘皮等皮損癥狀在PCOS 患者中有較高的發病率［1］。腸道微生物泛指人體腸道內寄生的微生物總和，在促進宿主腸道發育、調節免疫系統和營養物質獲取等方面發揮了關鍵的作用［2］。然而，腸道菌群紊亂可增加腸壁通透性，導致腸源性細菌及其代謝產物進入血液循環從而誘導炎癥反應［3］。持續性低度炎癥效應鈍化胰島素受體敏感性，使宿主表現肥胖、胰島素抵抗和代償性高胰島素血癥，進而增加卵巢中睪酮的合成與釋放［4］。近年來，腸道菌群紊亂與PCOS 的相關性得到了廣泛的關注。LIU 等［5］發現PCOS 患者腸道內Bacteroides、Escherichia/Shigella、Streptococcus 和Akkermansia 等類群發生顯著變化，且與患者臨床特征相關。而INSENSER 等［6］發現PCOS 患者腸道菌群多樣性降低，Catenibacterium 和Kandleria genera 菌群豐度異常升高。

痤瘡皮損是一種常見于PCOS 患者的損容性皮膚病，以局部皮膚粉刺、丘疹、囊腫和結節樣皮損為主要特征，好發于患者臉頸部以及胸背部，對患者的外在形象造成了嚴重的影響［7-8］。目前，痤瘡的發生機制仍未完全明確。臨床研究［9］表明，飲食因素對痤瘡的發生發展有重要的影響，暗示腸道菌群可能對痤瘡皮損有極為重要的意義。王萃等［10］發現痤瘡患者乳桿菌和雙歧桿菌數量顯著降低。門月華等［11］對重度痤瘡患者腸道菌群進行了分析，發現僅Blautia producta 和Coprococcus eutactus 發生了顯著的變化結果。雖然痤瘡和PCOS 相關的腸道菌群特征都已有報道，但痤瘡型PCOS 患者腸道菌群結構特征還有待進一步探究。

鑒于腸道菌群在疾病干預和防治中的重要作用，分析痤瘡型PCOS 患者的腸道菌群組成對于以腸道菌群為靶點的藥物設計和生活干預等方式改善PCOS 患者皮損有重要的指導意義。基于此，本研究以第二代測序技術比較了PCOS 患者與健康女性之間、NA-PCOS 與MSA-PCOS 患者之間腸道細菌組成差異，并對豐度差異顯著的菌群與患者胰島素抵抗、炎癥、血脂代謝、性激素水平之間的相關性進行了分析，為后續以調理腸道菌群改善PCOS 患者痤瘡皮損的研究提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑全自動生化分析儀（AU5800）購自美國Beckman 公司，彩色超聲診斷儀（HDI-4000）購自荷蘭Philips 公司，超微量分光光度計（ND2000）購自美國Thermo Scientific 公司，Miseq測序儀（PE300）購自美國Illumina，PCR 儀（Gene-Amp-9700）購自美國ABI，糞便微生物基因組抽提試劑盒購自德國Qiagen 公司，FastPfu PCR 擴增試劑盒購自北京全式金生物，C-反應蛋白（CRP）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒購自北京索萊寶生物。

1.2 研究對象PCOS 患者為2018年1-7月期間因月經周期異常或不孕癥就診于自貢市婦幼保健院的漢族女性。對照組由年齡匹配且排卵功能正常的健康漢族女性組成。受試者及其家屬對本次研究目的知情同意。PCOS 診斷參考2012年頒布的《多囊卵巢綜合征診斷中華人民共和國行業標準》執行，滿足排卵功能異常和卵巢多囊樣病變即為疑似PCOS 患者［12］。排除遲發型腎上腺皮質增生、柯興綜合征、甲狀腺功能異常、腎上腺雄激素分泌瘤及卵巢早衰等疾病的疑似患者。近3 個月內服用過激素類藥物的PCOS 確診患者也不被納入到本次研究中［5］。

采用GAGS 系統對受試者痤瘡程度進行評分［13］。發生區域因素評分標準：前額、右頰部和左頰部因素分值=2 分；鼻部和下頦區因素分值=1分；前胸及后背因素分值=3分；皮損程度評分標準：無皮損（0分）；≥1個粉刺（1分）；≥1個丘疹（2分）；≥1 個膿皰（3 分）；≥1 個結節（4 分）。區域分值=因素分值×皮損分值，綜合分值為各區域分值之和。結合中國人群體質特征，根據綜合分值將PCOS 患者劃為無痤瘡型PCOS（NA-PCOS，0 分）、輕度痤瘡型PCOS（Mild Acne-PCOS，MA-PCOS，1～18 分）和中重度痤瘡型PCOS（Medium-to-severe acne-PCOS，MSA-PCOS，≥19 分）。

1.3 臨床數據采集月經期第3 天清晨采集受試者空腹外周血，收集上層清液保存于-80 ℃備用。卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）、雌激素（E2）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）采用全自動生化分析儀測定。炎癥因子IL-6、TNF-α、CRP 采用試劑盒檢測。體質量指數（BMI）=體質量（kg）/身高（m2），18 kg/m2≤BMI ≤24.9 kg/m2為正常體質量指數，BMI ≥25 kg/m2為全身性肥胖；腰臀比（WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm），WHR ≥0.85 為向心性肥胖［5］。穩態模型胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=FINs×FPGs/22.5，HOMA-IR ≥2.5 為胰島素抵抗［14］。

1.4 統計學方法臨床數據以均值±標準差表示，數據處理和分析采用SPSS 17.0 軟件包進行。Kolmogorov-Smirnov 檢驗數據的正態分布性，正態分布數據的組間比較采用獨立樣本t 檢驗和單因素方差分析（Student-Newman-Keuls 檢驗）；非正態分布數據的組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗和Kruskal-Wallis H 檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

1.5 DNA 抽提、PCR 擴增、高通量測序新鮮糞便樣品（約200 mg）中細菌基因組DNA 參照試劑盒步驟抽提，調節DNA 濃度至10 ng/μL。細菌16S rDNA V3-V4 片段擴增采用通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′），產物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。高通量測序工作由上海美吉生物完成。

1.6 生物信息學分析生物信息學分析基于線上平臺I-sanger 完成（www.i-sanger.com，上海美吉生物醫藥）。經序列篩選、拼接及嵌合體序列去除后，將相似度97%以上的序列歸入同一個操作分類單元（OTU）。利用RDP 分類器對每個OTU 中的代表性序列進行物種分類注釋，在閾值為70%的情況下比對Silva SSU123 數據庫。生成的OTU 表格按照最少樣本序列數隨機抽平。Mother 軟件計算檢出OTU 數和Shannon 指數用以表示菌群的Alpha指數。基于加權UniFrac 距離的層級聚類和主坐標分析（PCoA）進行樣本比較分析（Beta 多樣性）。菌群豐度的組間比較采用非參數Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis 檢驗，并以Benjamini-Hochberg算法校正。Spearman 法分析PCOS 患者腸道菌群和臨床參數間的相關性，并繪制相關性熱圖。

2 結果

2.1 受試者情況概述根據GAGS評分系統，20例PCOS 患者被分為非痤瘡組（NA-PCOS，n = 10）和中重度痤瘡組（MSA-PCOS，n = 10）。3 組參與者年齡、BMI 和WHR 指數方面差異無統計學意義（P ＞0.05）。NA-PCOS 和MSA-PCOS 患者T、LH/FSH、TC、TG、LDL-C 水平均顯著升高而HDL-C 水平降低（P ＜0.05），NA-PCOS 和MSA-PCOS 組間差異有統計學意義（P ＜0.05）。MSA-PCOS 組FINs 和HOMA-IR 指數顯著高于HC 組和NA-PCOS 組，而NA-PCOS 患者與健康女性之間差異無統計學意義。炎癥因子方面，NA-PCOS 和MSA-PCOS 患者CRP、IL-6、TNF-α水平顯著升高，且MSA-PCOS 組明顯高于NA-PCOS 組。

2.2 組間腸道菌群差異分析從上述的30 例樣本中共獲得633 360 條高質量的序列，以97%的序列相似性聚類得到330 個OTUs。Alpha 多樣性分析表明，NA-PCOS 和MSA-PCOS 組Sobs 指數（圖1A）和Shannon 指數（圖1B）均低于HC 組，且差異有統計學意義（P ＜0.01）。而MSA-PCOS 組的Sobs 指數（圖1A）和Shannon 指數（圖1B）均低于NA-PCOS 組（P ＜0.05）。此外，本文基于加權Uni-Frac 距離的層級聚類（圖1C）和PCoA 分析（圖1D）表征個體腸道菌群組成的差異。HC 個體腸道菌群與PCOS 患者無交叉現象（圖1C），但組內樣本之間距離較遠（圖1D），表明健康個體腸道菌群組成也存在一定的差異性。NA-PCOS 與MSA-PCOS 樣本之間雖存在一定程度的交叉（圖1C），但總體組內樣本的相似性仍高于組間樣本比較（圖1D）。

與HC 組相比，NA-PCOS 組患者腸道菌群組成在門水平上無特征性改變（P ＞0.05），而MSA-PCOS組Firmicutes 豐度顯著升高（P ＜0.05）（圖2A、B）。在屬水平上（圖2C、D），Prevotella 在大多數的健康女性腸道內具有較高的相對豐度（7/10），而在PCOS 患者腸道內均未能檢出（0/20）。但NA-PCOS和MSA-PCOS患者腸道中Bacteroides的相對豐度均顯著高于HC 組（P ＜0.001），且MSA-PCOS 組高于NA-PCOS 組（P ＜0.001）。Faecalibacteruim 在PCOS患者中腸道菌群中的相對豐度降低，MSA-PCOS 患者與健康女性相比差異有統計學意義（P ＜0.05）。

表1 受試者臨床參數特征Tab.1 Clinical parameters of subjects ±s

表1 受試者臨床參數特征Tab.1 Clinical parameters of subjects ±s

注：HC 組和NA pcos 組比，aP ＜0.05；HC 組與MSA-PCOS 組相比，bP＜0.05；NA-PCOS 組與MSA-PCOS 組比，cP ＜0.05

臨床參數年齡（歲）BMI（kg/m2）WHR T（nmol/L）FSH（IU/L）LH（IU/L）LH/FSH E2（pmol/L）CRP（mg/L）IL6（ng/L）TNF-α（ng/L）FPG（mmol/L）FINs（μIU/mL）HOMA-IR TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）GAGS HC（n=10）26.6±3.80 22.35±1.92 0.74±0.06 0.66±0.29a，b 6.43±0.91b 3.27±0.49b 0.52±0.11b 245.89±87.4a 2.14±0.27a，b 2.36±0.50b 15.01±2.16a，b 5.20±0.34 6.65±2.46b 1.53±0.54b 0.79±0.21a，b 3.89±0.45b 2.16±0.37b 1.61±0.74a，b-PCOS（n=20）NA-PCOS（n=10）24.8±5.57 22.37±4.07 0.76±0.02 1.22±0.59a，c 5.92±0.94 6.80±4.09c 1.13±0.62c 150.15±73.78a 3.10±0.38a，c 2.56±0.62c 19.66±3.28a，c 4.87±0.50 7.78±2.03c 1.679±0.46c 1.61±0.52a，c 1.25±1.25 2.04±0.37c 2.40±0.39a，c-MSA-PCOS（n=10）23.8±3.49 25.92±3.27 0.82±0.07 2.88±0.55b，c 5.14±0.85b 13.34±5.67b，c 2.59±0.93b，c 180.04±83.27 5.03±1.06b，c 5.05±1.46b，c 24.25±3.72b，c 5.12±0.60 19.63±5.91b，c 4.45±1.39b，c 2.33±0.40b，c 4.93±0.57b 1.17±0.29b，c 2.91±0.39b，c 21.2±2.66

2.3 PCOS 患者臨床參數與腸道菌群相關性分析進一步地，本文對PCOS 患者腸道菌群與臨床參數的相關性進行了Spearman 分析。結果如圖3所示，Bacteroides 分別與HOMA-IR、T、LH/FSH、CRP、IL-6、TNF-α、LH 和TG、TC 呈正相關，但與E2負相關（P ＜0.05）。Faecalibacterium 與HOMA-IR、T、CRP、IL-6、TNF-α 和TG、TC 呈負相關（P ＜0.05）。

3 討論

圖1 腸道菌群多樣性分析Fig.1 Alpha and beta diversity analysis of the gut microbiota

圖2 受試者腸道菌群組成分析Fig.2 Composition of the gut microbial community in participants

圖3 主要腸道微生物與PCOS 臨床參數相關性Fig.3 Spearman correlation between PCOS-associated parameters and the main genera of gut microbial community

本研究首先對PCOS 患者腸道菌群組成進行了分析。結果表明，PCOS 患者腸道菌群多樣性降低（P ＜0.05）。其中，Prevotella 相對豐度在PCOS患者糞便中顯著減少，且幾乎檢測不到。另一方面，本研究還發現Bacteroides 的相對豐度在PCOS患者中顯著升高（P ＜0.001），成為優勢菌群。在此前的研究中，多篇文獻對PCOS 患者腸道菌群進行了分析，但均為得到一致的結論。LIU 等［5］分析了中國PCOS 人群腸道菌群發現PCOS 患者腸道菌群多樣性降低，Bacteroides、Escherichia/Shigella、Streptococcus 和Akkermansia 等類群發生顯著變化；INSENSER 等［6］發現西班牙PCOS 患者腸道菌群多樣性降低，Catenibacterium 和Kandleria genera菌群豐度異常升高；而LINDHEIM 等［15］對澳大利亞PCOS 女性的腸道菌群進行分析后發現相對豐度大于1%的類群與健康女性相比無顯著差異。引起上述研究結果差異的原因可能在于：（1）受試人群的篩選，如本文參考的是衛生部2012年頒布的《多囊卵巢綜合征診斷中華人民共和國衛生行業標準》，而Insenser 和Lindheim 等參考的則是2003年制定的鹿特丹準則；（2）受試者種族因素的影響：LIU 等［5］的研究也發現Bacteroides 在中國PCOS 人群腸道中相對豐度會升高；（3）受試者地理環境、生活方式和飲食結構的影響。

痤瘡皮損嚴重損害了患者的外在形象，是PCOS 患者最為關注的問題之一。本文對MSAPCOS 與NA-PCOS 患者腸道菌群結構進行了比較。結果發現，MSA-PCOS 患者腸道菌群多樣性進一步降低，但Bacteroides 的相對豐度進一步升高至70%，顯著高于NA-PCOS 患者（P ＜0.01）。這表明，痤瘡型PCOS 患者腸道菌群紊亂比非痤瘡PCOS 患者更為顯著。此前的研究［16-18］發現，腸道內Bacteroides 相對豐度升高可能通過介導炎癥效應參與胰島素抵抗、肥胖等疾病的發生發展。本研究表明，Bacteroides 豐度的異常升高與PCOS 患者胰島素抵抗、炎癥、血脂異常水平存在著密切的相關性，這暗示著可以將調節Bacteroides 豐度作為治療和緩解PCOS 癥狀的潛在靶點。

當然，本研究也存在一定的局限性和需要改進之處。首先，本研究未對痤瘡患者（非PCOS）的腸道菌群進行分析。王萃和門月華等［10-11］的研究均發現痤瘡患者腸道菌群發生顯著的改變。因此，后續研究中比較痤瘡患者與痤瘡型PCOS 患者的腸道菌群的變化趨勢是否一致；其次，本研究僅分析了MSA-PCOS的腸道菌群結構，而MA-PCOS 患者的腸道菌群組成還有待進一步探究；此外，本研究納入的受試者主要考察是否符合PCOS 的臨床診斷標準，而未排除PCOS 患者中的肥胖個體。雖然相關性分析表明，在PCOS 受試者中，BMI 和WHR與主要腸道類群無顯著相關性，但肥胖是否介導PCOS 患者腸道菌群和痤瘡之間的影響仍需要進一步探究。在后續研究中，本研究將對輕度和重度痤瘡型PCOS 患者的腸道菌群進行分析，并排除肥胖（包括全身性肥胖和向心性肥胖）、胰島素抵抗等疾病對腸道菌群和痤瘡之間相關性的干擾。

總體而言，本文分析了腸道菌群失調與PCOS患者（特別是痤瘡型PCOS 患者）胰島素抵抗、高雄激素血癥、炎癥、血脂異常等水平的相關性。鑒于胰島素抵抗、雄激素和炎癥在PCOS 和痤瘡發生發展中的重要角色，筆者推測腸道菌群紊亂（特別是Bacteroides 異常增多）可以引起慢性系統性炎癥、胰島抵抗和高雄激素血癥，進而加重PCOS 患者的痤瘡程度。在后續的研究中，筆者將通過分析患者腸道菌群功能特征、調節患者菌群結構以及模式動物研究等方法對這一猜想進行驗證。