變應性鼻炎合并鼻息肉患者免疫治療前后外周血叉頭狀轉錄因子p3 與細胞抗原識別受體Vγ 亞家族基因表達的特點

汪瓊 孫群 陳其國 楊欽泰 李浩

1深圳市寶安區石巖人民醫院（廣東深圳518108）；2中山大學附屬第三醫院（廣州510630）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是吸入性變應原由鼻腔黏膜進入機體后誘發的以Th2 免疫應答為主的炎性反應，是全身變應性疾病在上呼吸道的表現［1］。慢性鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）是累及鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎癥，西方國家以Th2 炎癥和嗜酸性粒細胞（eosinophil，Eos）浸潤為主要特征［2］，亞洲人群雖具有更高的異質性，但近年來該內型的比例顯著升高，也已成為最主要的病理類型［3］。大量研究發現，AR 患者合并鼻息肉（nasal polyps，NP）（allergic rhinitis with nasal polyps，ARwNP）的比例明顯高于非AR 患者，且與單純AR 或單純NP 相比，ARwNP 患者的疾病嚴重程度更高、對藥物和手術等治療的反應性更差，且易合并哮喘等系統性炎性疾病［4-5］。特異性免疫治療（specific immunotherapy，SIT）是目前臨床上針對AR 唯一的對因療法，已成為臨床一線治療方案［6］，其作用機制還不完全清楚。

變應性疾病存在著調節性T 細胞（T regulatory cells，Treg）數量低下及功能缺陷，SIT 治療則可使其獲得恢復［7］。新近研究發現［8］，γδT 細胞的不同亞群在不同條件下可發揮促炎或抑炎功能，在呼吸道變應性炎癥中具有重要作用。近來有研究證實，在自身免疫性疾病中γδT 細胞可通過產生Th17 細胞相關細胞因子抑制Treg 的應答，從而促進炎癥發展［9］；在AR 中γδT 細胞與Treg 也可能存在互相調節的作用［10］。然而，Treg 與γδT 細胞是否參與ARwNP 及其SIT 治療過程還未見報道，因此明確Treg 與γδT 細胞在ARwNP 患者接受SIT 治療前后的表達情況及其相互作用，對于進一步揭示ARwNP 發病機制和SIT 治療作用機制具有重要意義。本研究檢測了接受治療的ARwNP患者在治療前后外周血叉頭狀轉錄因子p3（forkhead box p3，Foxp3）與TCR VγⅠ～Ⅲ亞家族基因表達水平，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究經深圳市寶安區石巖人民醫院倫理委員會批準，取得研究對象的同意并簽署書面知情同意書。于2017年10月至2018年12月在深圳市寶安區石巖人民醫院耳鼻咽喉-頭頸外科門診，招募18 例不愿接受手術的粉塵螨單一變應原敏感的持續性AR 合并NP 患者，診斷標準根據“變應性鼻炎診斷和治療指南（2015年，天津）［14］”和“中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南［15］”，給予標準化粉塵螨變應原（我武生物公司，浙江）SLIT，其中男10 例，女8 例，年齡18 ～38 歲，中位年齡27歲。SLIT 方案：初始治療階段（遞增期），第1周使用暢迪粉塵螨滴劑1 號（蛋白濃度為1 μg/mL），第2 周暢迪2 號（10 μg/mL），第3 周暢迪3 號（100 μg/mL），使用量均逐天增加，第1 天1 滴，第2天2 滴，第3 天3 滴，第4 天4 滴，第5 天6 滴，第6 天8 滴，第7 天10 滴；維持治療階段（維持期），第4 ～5 周使用暢迪4 號（333 μg/mL），每天3 滴，第6 周起使用暢迪5 號（1 000 μg/mL），每天2 滴。服用方法：將液滴滴于舌下，含1 ～3 min 后吞咽，每天1 次，固定時間用藥。分別于開始治療前和治療滿1年后進行血常規檢查、鼻內鏡檢查、鼻內鏡下取鼻息肉組織，并抽取經肝素鈉抗凝的外周靜脈血2 mL。招募健康志愿者8 例，其中男4 例，女4 例，年齡18 ～40 歲，中位年齡27.5 歲，均無任何變應性疾病臨床癥狀且血清sIgE 陰性。ARwNP 患者開始治療前和健康志愿者1月內均未接受口服激素、抗組胺藥物及免疫治療。

1.2 鼻部總癥狀評分在開始治療前和治療滿1年后分別對ARwNP 患者進行鼻部總癥狀評分（total nasal symptom score，TNSS）（范圍0 ～12），評分方法：分別對鼻塞、清水樣涕、鼻癢和噴嚏癥狀進行評估，無癥狀記0 分，癥狀輕微、易于忍受記1 分，癥狀明顯、但可忍受記2 分，癥狀不能忍受、影響日常生活和睡眠記3 分，將單個癥狀評分相加得到總分［16］。

1.3 鼻息肉大小評分在開始治療前和治療滿1年后分別對ARwNP 患者進行鼻內鏡下鼻息肉大小評分（nasal polyp size score，NPSS）（范圍0 ～8分），評分方法：分別對雙側鼻息肉大小進行評估，未見鼻息肉記0 分，鼻息肉局限于中鼻道內（未完全阻塞中鼻道）記1 分，鼻息肉完全阻塞中鼻道記2 分，鼻息肉超過中鼻道但未完全阻塞總鼻道記3 分，鼻息肉完全阻塞總鼻道記4 分，將雙側評分相加得到總分［16］。

1.4 鼻息肉組織蘇木精-伊紅染色在開始治療前和治療滿1年后分別在鼻內鏡下取患者鼻息肉組織，用4%多聚甲醛固定24 h 后，用石蠟包埋，隨后切成4 μm 厚的切片，進行（hematoxylin-eosin，HE）染色，隨機選取10 個高倍鏡下視野（400 ×），計數固有層Eos 和總炎性細胞，并計算Eos 占總炎性細胞的百分比。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）使用Ficoll 密度梯度離心法提取外周血中單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），參照試劑盒說明提取總RNA（RNAiso Plus 試劑盒，TaKaRa，Japan）并反轉錄合成cDNA 第一鏈（Prime-ScriptTMRT Master Mix 試劑盒，TaKaRa，Japan），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因作為內參基因，檢測Foxp3 與TCR Vγ Ⅰ～Ⅲ亞家族基因的表達水平（FastStart Universal SYBR Green Master 試劑盒，Roche，Germany）［13］。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1，其中根據TCR Vγ 基因的3 個亞家族分別設計3 條上游引物（VγⅠ～Ⅲ），并設計一共同下游引物Cγ。總反應體系為20 μL，包括1 μL cDNA、1 μL 上游引物（0.6 μmol/L）、1 μL 下游引物（0.6 μmol/L）、10 μL ddH2O 以及10 μL 2 ×FastStart Universal SYBR Green Master；每例標本設置2 個復孔，在95 ℃預變性10 min 后進行40 個循環擴增，每一循環包括95 ℃10 s、60 ℃30 s，并以0.5 ℃/s 變化速度在60 ℃～95 ℃每隔5 s 記錄1 次熒光值，以獲得熔解曲線［16］。反應在CFX96TM Real-Time PCR cycler（BioRad，USA）中進行。為排除假陽性結果，所有樣品均設置無模板陰性對照。采用比較Ct 法分析各組目的基因的mRNA 相對于GAPDH 基因的表達水平。

1.6 統計學方法使用GraphPad Prism 6.0 統計軟件進行分析。計量資料以（±s）或中位數表示，兩組均數間的比較采用t 檢驗或Mann-Whitney 檢驗，ARwNP 治療后組與治療前組均數間的比較使用配對t 檢驗或Wilcoxon 檢驗，相關性分析使用Pearson 或Spearman 秩相關分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

表1 RT-qPCR 所用引物序列Tab.1 Sequences of primers used in RT-qPCR

2 結果

2.1 ARwNP患者SLIT治療后臨床參數的變化為了評估SLIT 治療的效果，筆者首先分析了ARwNP 患者在治療滿1年后臨床參數的變化。結果顯示，與治療前相比，治療后TNSS、NPSS、外周血Eos 比例以及NP 組織中Eos 比例均顯著降低（表2、圖1）。

表2 ARwNP 患者SLIT 治療后臨床參數的變化Fig.2 Changes of clinical parameters after SLIT in patients with ARwNPM（Q）

圖1 ARwNP 患者治療前后NP 組織Eos 水平Fig.1 Eoslevelin NP tissues of patients with ARwNP before and after SLIT

2.2 健康人與ARwNP患者Foxp3與TCR Vγ亞家族mRNA 相對表達水平結果顯示：ARwNP 患者治療前Foxp3 基因表達水平明顯低于健康對照組，治療1年后與開始治療前相比明顯升高，而與健康對照相比差異無統計學意義（圖2A）。TCR VγⅠ～Ⅲ亞家族基因表達模式，在健康對照組和ARwNP 患者SLIT 治療前后均為：TCR VγⅡ＞TCR VγⅠ＞TCR VγⅢ。TCR VγⅠ～Ⅲ亞家族的基因表達水平，治療前與健康對照組相比均明顯下降；治療后TCR VγⅠ與Ⅱ亞家族與治療前相比差異無統計學意義，TCR VγⅢ亞家族治療后則比治療前明顯升高；治療后TCR VγⅠ和Ⅲ亞家族與健康對照相比差異無統計學意義，TCR VγⅡ亞家族治療后則比健康對照明顯降低（圖2B ～2D）。

2.3 ARwNP 患者Foxp3、TCR Vγ 亞家族基因表達水平與臨床參數的相關性分析結果發現，ARwNP 患者治療前，Foxp3 基因表達水平與TCR VγⅢ亞家族基因表達水平呈正相關；Foxp3 基因表達水平與外周血Eos 比例呈負相關；但Foxp3基因表達水平與TCR VγⅠ和Ⅱ亞家族基因表達水平、TNSS、NPSS均無明顯相關性；TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ亞家族基因表達水平與TNSS、NPSS、外周Eos 比例也均無明顯相關性（圖3A ～3B）。

圖2 ARwNP 患者外周血Foxp3 與TCR Vγ 亞家族mRNA 相對表達水平Fig.2 Relative mRNA expression levels of Foxp3 and TCR Vγsubfamilies in peripheral blood of patients with ARwNP

AR 患者治療后，Foxp3 基因表達水平與TCR VγⅡ、Ⅲ亞家族基因表達水平均呈正相關；Foxp3基因表達水平與TNSS 呈負相關；TCR VγⅢ亞家族基因表達水平與外周血Eos比例呈負相關；但Foxp3基因表達水平與TCR VγⅠ亞家族基因表達水平、NPSS、外周血Eos比例均無明顯相關性；TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ亞家族基因表達水平與TNSS、NPSS均無明顯相關性，TCR VγⅠ、Ⅱ亞家族基因表達水平與外周血Eos比例也均無明顯相關性（見圖3C ～3F）。

圖3 Foxp3 基因、TCR Vγ 亞家族基因表達水平與臨床參數的相關性Fig.3 Correlations between Foxp3 and TCR Vγgene expression levels and clinical parameters

3 討論

AR 和NP 是全球最主要的上呼吸道慢性炎性疾病，目前雖無充分證據證實AR 可導致NP 的發病，但AR是NP的重要誘發因素的觀點已獲得廣泛認可［14］。SLIT 可恢復機體免疫耐受、糾正免疫失衡，是目前臨床上針對AR唯一的對因療法，其有效性已被大量研究證實［6］，但目前極少有研究涉及其對ARwNP 患者的治療效果及作用機制。在本研究中，接受SLIT 的ARwNP 患者在治療1年后鼻部總癥狀評分、鼻息肉大小評分、外周血及NP 組織Eos比例這4 項臨床參數的均數均較治療前的基線水平明顯下降，表明SLIT對ARwNP的治療總體有效，SLIT 不僅可以改善ARwNP 患者的鼻部癥狀，且可以縮小鼻息肉，并減輕機體的嗜酸性炎癥。

研究［15］表明，Treg 可通過產生抑制性細胞因子IL-10 和TGF-β 而抑制過度的Ⅰ型超敏反應，在變應原的免疫耐受過程中具有關鍵作用。研究［16］發現，Foxp3+Treg 的數量和功能在呼吸道變應性炎癥的外周血中明顯降低，而SLIT 可使其數量得到回升，且使其功能獲得恢復。本研究結果顯示，ARwNP患者外周血中Foxp3 mRNA表達水平在SLIT治療前明顯低于健康人，提示ARwNP 中Treg 數量減少，其免疫抑制功能可能受到影響；而在接受SLIT 治療1年后，Foxp3 mRNA 表達水平明顯高于治療前，提示Treg 的數量和功能可能得到了糾正。此外，Foxp3 mRNA 水平在ARwNP 患者治療前后與外周血Eos 比例呈負相關，在治療后與患者鼻部總癥狀評分呈負相關，提示Treg 與患者的外周血嗜酸性炎癥以及癥狀嚴重程度可能存在負相關的關系，更加提示了其在抑制ARwNP 的炎癥中可能發揮著舉足輕重的作用。

γδ T 細胞可根據分泌的功能不同甚至相反的細胞因子而分為不同的功能亞群［17］，但在ARwNP及其SLIT 中哪些亞家族對應哪些功能亞群還不清楚。最近一項研究發現，AR 患者TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ的基因表達水平與健康人無明顯差異，在接受皮下SLIT 治療后明顯下降［10］。而本研究首次發現，ARwNP 患者外周血中TCR VγⅠ、Ⅱ、Ⅲ基因的表達水平在SLIT 治療前均明顯低于健康人，在治療1年后，VγⅢ水平較治療前明顯升高，且與外周血Eos 比例呈負相關，提示TCR Vγ 家族，尤其是VγⅢ亞家族與ARwNP 的發病密切相關，且可能在SLIT 治療早期與外周血嗜酸性炎癥存在負相關的關系，提示其可能在ARwNP 中發揮抑炎功能。

近年研究發現，在多種自身免疫性疾病中，γδT細胞能夠在炎癥局部通過大量分泌干擾素γ 等細胞因子，影響Treg 的分化和功能，進而發揮抑炎或促炎作用［22］。在本研究中，Foxp3 mRNA 表達水平在ARwNP 患者治療前與VγⅢ表達水平呈正相關，在治療后與VγⅡ、Ⅲ水平呈正相關，強烈提示在ARwNP 及其SLIT 治療早期，Treg 與γδ T 細胞的TCR VγⅢ亞家族可能存在著相互調節作用和動態平衡關系。當然，目前本研究主要集中分析了Treg與γδ T 細胞的TCR VγⅢ亞家族在ARwNP 及SLIT早期的可能作用，而對于其在SLIT 的長期治療中的作用及其具體機制仍需要通過更大的樣本量、更長的研究周期以及動物實驗等進一步深入研究。