結直腸癌分子亞型共識簡介及各亞型特征分析

閆兆鵬，蘇 琪

(中國醫科大學附屬盛京醫院第八普通外科，沈陽 110004)

在世界范圍內，結直腸癌是導致腫瘤相關死亡的主要原因[1-3]。我國結直腸癌發病率有逐年升高的趨勢，經規范治療的確診結直腸癌患者的5年生存率約為60%[2]。目前，結直腸癌的治療以手術治療為主，并聯合其他放療、化療、靶向治療、免疫治療等輔助治療手段。近年來，結直腸癌的手術治療技術進展迅速，相繼出現腹腔鏡技術、括約肌間切除術、保留自主神經的直腸癌根治術、經自然腔道內鏡手術、經肛全直腸系膜切除術等新技術，這些技術主要以提高結直腸癌患者生活質量為主，即微創、功能保護、保肛率提高等，對改善患者預后的作用有限。近年來，結直腸癌病死率顯著下降主要得益于輔助治療技術的進步。輔助治療的選擇主要以腫瘤的TNM分期為基礎，TNM分期是目前對判斷預后價值最大的腫瘤分期方法，主要以腫瘤的病理學和解剖學為依據對結直腸癌進行分期[4]。但TNM分期不能有效地區分腫瘤異質性導致的腫瘤生物學行為的差異，導致以TNM分期為依據進行的輔助治療的精準性不足。由于腫瘤的生物學行為存在差異，導致處于同一TNM分期的結直腸癌患者的預后及對輔助治療反應的差異較大。有研究指出，左半結腸癌與右半結腸癌的解剖學特征、組織學特征、預后以及腫瘤生物學行為均存在差異[5]。

美國國立綜合癌癥網指南指出，對于轉移性不可切除的結直腸癌，因RAS基因突變狀態的不同，患者對西妥昔單抗的治療效果亦不相同。在精準治療時代，急需一種能夠根據腫瘤異質性對結直腸癌進行分類的方法，并在分子生物學層面對腫瘤進行分型。Guinney等[6]提出了以基因表達為基礎的結直腸癌分子亞型共識(consensus molecular subtypes，CMS)。現以結直腸癌CMS為框架，從分子層面對每種分子亞型的臨床特征、臨床意義以及腫瘤生物學行為予以綜述。

1 CMS概述

結直腸癌是高度異質性的惡性腫瘤，包括腫瘤間異質性和腫瘤內細胞間異質性。腫瘤的異質性由基因突變、表觀遺傳學改變、腫瘤微環境(腫瘤間質、局部免疫反應)、血管生成及缺氧等因素決定。腫瘤的異質性決定了不同個體腫瘤的生物學行為、預后、對輔助治療的反應各不相同[7-8]。Guinney等[6]提出的以基因表達為基礎的結直腸癌CMS，通過收集3 000余例結直腸癌患者的病理學與分子生物學數據，使用隨機森林算法將結直腸癌分為CMS1(免疫型)、CMS2(經典型)、CMS3(代謝型)、CMS4(間質型)4個亞型。CMS1的典型特征是免疫細胞浸潤腫瘤微環境、高度微衛星不穩定、高度CpG島甲基化表型、低體細胞拷貝數量改變以及BRAF基因突變。CMS2典型特征為Wnt信號通路激活、APC基因突變和染色體不穩定。CMS3與KRAS基因突變關系密切，約30%的染色體不穩定是高度微衛星不穩定[6]。CMS4以癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)浸潤鄰近腫瘤組織以及轉化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)的高表達為典型特征。TGF-β在腫瘤細胞的干細胞化、促進腫瘤血管生成、重塑腫瘤基質、激活補體炎癥系統等過程中均發揮重要作用。現將各型CMS的特征歸納如下，見表1。

2 CMS1

CMS1以免疫細胞浸潤腫瘤微環境為主要特征。腫瘤微環境由上皮細胞、血管和淋巴管、間質細胞、浸潤的免疫細胞組成[9]。腫瘤局部浸潤的免疫細胞主要通過與腫瘤微環境的相互作用而發揮作用，可影響腫瘤對免疫治療、化療以及放療的反應，在結直腸癌的進展中起重要作用。

CMS1具有高度的免疫細胞浸潤特征。腫瘤浸潤免疫細胞的種類及其在結直腸癌中的作用與免疫細胞的種類及其定位相關。在腫瘤進展過程中，不同的免疫浸潤細胞在不同腫瘤中具有不同的作用[9-10]。

表1 各型CMS的特征

CMS：分子亞型共識；MSI：微衛星不穩定；MSI-L：低度微衛星不穩定；MSS：微衛星穩定；CIMP：高度CpG島甲基化表型；SCNA：體細胞拷貝數量改變；CIN：染色體不穩定；TGF-β：轉化生長因子-β；CTL：細胞毒性T淋巴細胞；NK：自然殺傷細胞；-：無相關數據

有研究表明， 結直腸癌中的腫瘤免疫細胞浸潤與預后相關，但具體相關性尚不明確。目前已知的對腫瘤有抑制作用的免疫細胞包括CD8+細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、經典樹突狀細胞、M1型巨噬細胞、N1型中性粒細胞；對腫瘤有促進作用的免疫細胞包括CD4+淋巴細胞、CD25+淋巴細胞、調節性樹突狀細胞、髓系樹突狀細胞、M2型巨噬細胞、N2型中性粒細胞[11-15]。腫瘤細胞可釋放TGF-β，抑制自然殺傷細胞的活性，在腫瘤發生的早期，自然殺傷細胞具有保護作用，但腫瘤生長到可被檢測出的體積時，自然殺傷細胞則不再發揮保護作用[16]。

腫瘤浸潤免疫細胞可定位于腫瘤中心、腫瘤侵襲邊緣或三級淋巴結構。在結直腸癌中，淋巴細胞主要定位于腫瘤中心和侵襲邊緣。記憶性CD4+T細胞和記憶性CD8+T細胞的密度可隨腫瘤浸潤深度的增加而降低，即隨著腫瘤浸潤深度的增加，T細胞密度降低[17]。腫瘤中心有高密度記憶性CD4+T細胞和記憶性CD8+T細胞的原發結直腸癌患者腫瘤復發病灶中心的記憶性CD4+T細胞和記憶性CD8+T細胞減少[17]。尤其肝轉移病灶，T細胞僅在腫瘤組織邊緣浸潤，而腫瘤組織中央無浸潤。若在肝轉移患者腫瘤組織邊緣發現CD8+T細胞浸潤，提示化療效果較好且患者生存期較長。但尚不能確定生存期延長是免疫系統的保護作用還是化療的作用。

除了TNM分期，免疫細胞浸潤的模式是預測無病生存期和總生存期的最顯著指標[18]。多項研究發現，CD3+T細胞、CD8+細胞毒性T細胞、記憶性CD45RO+T細胞與無病生存期和總生存期的延長有關[19-21]。有研究發現，CMS1的總生存期和無病生存期均高于CMS4，與上述文獻報道相吻合，但CMS1復發后的生存率低于CMS2、CMS3、CMS4，提示CMS1復發者可能存在免疫逃逸，腫瘤浸潤免疫細胞不再發揮抑瘤作用[6]。此外，編碼細胞因子CX3趨化因子配體1、CXC趨化因子配體9、CXC趨化因子配體10的基因高表達與T細胞浸潤以及無病生存期和總生存期的延長有關[22]。

高度微衛星不穩定是CMS1結直腸癌的主要特征，可導致大量新抗原的產生，并可進一步誘發免疫細胞浸潤腫瘤基質。若能夠對大量新抗原進行鑒定，則可將其作為診斷結直腸癌的新型腫瘤標志物。

3 CMS2

CMS2符合經典的結直腸癌“腺瘤-腺癌”模型。CMS2結直腸癌約占全部結直腸癌的40%，其主要特征是WNT信號通路的下游靶點(尤其是APC基因)高頻突變和TP53基因高頻突變，符合經典的結直腸癌演進模型，即“APC基因突變-腺瘤-TP53基因突變-腺癌”的模型[6]。

Wnt信號通路對胚胎發育過程起重要作用，可維持腸干細胞的分化和穩態[23]。Wnt信號通路的突變和異常激活與消化系統腫瘤的發生關系密切。APC基因是具有多種功能的腫瘤抑制基因。正常情況下，APC可與β聯蛋白結合形成復合物，并降解β聯蛋白。當APC基因突變時，細胞質中的β聯蛋白不能被降解，高濃度β聯蛋白進入細胞核，與TGF形成復合體，調控c-myc和p21的活性，抑制上皮細胞分化，促進結直腸癌的發生[24]。CTNNB1負責編碼β聯蛋白，但少有CTNNB1突變導致β聯蛋白增加而促使結直腸癌發生的病例[25]。TP53基因為腫瘤抑制基因，TP53突變見于50%以上的人類惡性腫瘤[25-26]。TP53基因編碼p53蛋白，p53蛋白具有調整細胞周期、誘導細胞凋亡、維持基因組穩定、抑制腫瘤血管生成的作用。正常p53蛋白可與DNA特異性結合，在G1期檢測DNA損傷情況，根據DNA損傷的嚴重程度決定修復DNA或誘導細胞凋亡。當TP53基因突變失活時，缺少p53蛋白對細胞增殖的調控，導致腫瘤發生。

經典結直腸癌“腺瘤-腺癌”模型提出后，結直腸癌的生成機制已基本明確，但隨后的研究發現，某些結直腸癌并不遵循經典“腺瘤-腺癌”模型[27]。根據CMS對經典結直腸癌“腺瘤-腺癌”模型的描述，推測CMS本質上可能與CMS2結直腸癌的特征吻合。

4 CMS3

CMS3是4種結直腸癌分子亞型中唯一存在KRAS基因高頻度突變的亞型，并以KRAS基因突變為主要特征。RAS蛋白有非活化狀態(野生型)和活化狀態(突變型)兩種狀態。通常情況下，RAS蛋白處于非活化狀態，定位于細胞質膜的內表面，某些外界刺激可激活RAS蛋白，傳遞生長信號，刺激細胞增殖。Kras的激活途徑主要有3種：①RAS蛋白自身突變可導致Kras信號通路的激活；②激活和過表達RAS基因上游受體的酪氨酸激酶可導致Kras通路異常激活；③RAS基因下游BRAF的激活也可導致整個RAS信號通路的激活[26]。Wnt/β聯蛋白通路與RAS/胞外信號調節激酶途徑存在相互作用，Wnt/β聯蛋白通路可調節RAS蛋白的穩定性。Wnt激活或APC失活均可導致糖原合成酶激酶3β失活，使RAS處于穩定狀態，包括K-ras、N-ras、H-ras。APC失活可導致β聯蛋白和RAS的水平顯著升高[28-30]。

K-ras基因是指南中少見的對治療有指導意義的基因。在臨床實踐中，K-ras基因突變預示著預后較差以及靶向藥物西妥昔單抗治療無效。CMS3結直腸癌是最少見的亞型，占全部結直腸癌的10%[6]。有文獻報道，RAS突變患者約占全部結直腸癌患者的14%，與CMS3結直腸癌接近，因此可推測CMS3結直腸癌本質上可能就是RAS突變型結直腸癌[25-26]。

5 CMS4

既往對結直腸癌治療與分子機制的研究主要集中在癌細胞本身，但近年來的研究證實，腫瘤細胞外基質亦在腫瘤的進展中發揮重要作用[31]。CMS4的主要特征為CAFs浸潤鄰近腫瘤組織及腫瘤干細胞化，在CMS4結直腸癌中，可見CAFs浸潤腫瘤間質。腫瘤間質的CAFs主要有兩個來源，腫瘤細胞可招募成纖維細胞，并可進一步分泌細胞因子促進成纖維細胞分化，形成腫瘤纖維組織化；此外，CAFs還可來源于骨髓間充質干細胞，間充質干細胞被招募到腫瘤微環境，分化為CAFs[31-32]。有研究發現，腫瘤細胞分泌的TGF-β、血小板衍生生長因子、白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-6、胰島素樣生長因子、前列腺素E具有誘導CAFs分化的功能[25-26]。CAFs可通過與腫瘤細胞或其他微環境細胞的相互作用來促進腫瘤的進展。

腫瘤細胞誘導CAFs產生，CAFs可大量分泌IL-6。IL-6是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，可增加血管的通透性、誘導細胞外基質變性、促進血管內皮細胞遷移和增殖[33]。CAFs分泌的前列腺素E2可介導IL-6上調血管內皮生長因子的表達[34]。細胞實驗證實，與單獨培養CAFs相比，CAFs與結直腸癌細胞共同培養可產生更多的血管內皮生長因子[35]。結直腸癌細胞和CAFs可招募具有免疫抑制作用的髓源抑制細胞，抑制獲得性免疫，并通過改變細胞微環境抑制效應性T細胞的生長、激活、遷移。髓源抑制細胞還可抑制自然殺傷細胞的功能，增加調節性T細胞的數量。調節性T細胞的細胞浸潤與結直腸癌的不良預后相關[36]。TGF-β在CMS4結直腸癌中高表達，高表達的TGF-β可刺激CAFs分泌IL-11，觸發激活糖蛋白-130/信號轉導及轉錄激活因子3信號通路，增強遷移細胞的存活能力[37]。

腫瘤組織中的基質金屬蛋白酶高于正常組織，也與CAFs密切相關。此外，CAFs中Snail基因的表達增加，可見Snail等發育信號通路也與CAFs關系密切。Snail1作為轉錄因子可促進上皮-間充質轉化，導致腫瘤細胞遷移，促進轉移發生[38]。CAFs還可導致腫瘤內部血管生成減少，從而誘導缺氧，產生缺氧誘導因子，增強腫瘤的侵襲能力。

CAFs還可促進新生血管生成，抑制CAFs可阻斷血管生成。腫瘤血供不足可誘導缺氧誘導因子的產生，而缺氧誘導因子可提高腫瘤細胞的侵襲能力。因此，對于CMS4結直腸癌，聯合抑制CAFs以及阻斷缺氧誘導因子途徑可能成為一種潛在的治療方案。此外，CMS4結直腸癌對化療存在抵抗，能否通過抑制CAFs減少腫瘤間質，以提高CMS4結直腸癌對化療的敏感性有待進一步探索。

6 小 結

CMS1是APC基因突變導致大量新抗原產生，進而誘導免疫細胞浸潤。CMS2符合原癌基因激活與抑癌基因失活的經典結直腸癌“腺瘤-腺癌”模型。CMS3為RAS基因突變型的結直腸癌。CMS4與腫瘤干細胞或腫瘤細胞干細胞化的關系密切，且腫瘤細胞干細胞化的過程與腫瘤間質細胞關系密切。結直腸癌CMS通過生物信息學和人工智能的方法，根據腫瘤的分子生物學、腫瘤突變基因譜、腫瘤微環境等將結直腸癌分為4種亞型，此分型不同于既往根據腫瘤病理學指標(侵犯深度、淋巴結轉移、遠處轉移等)對結直腸癌進行的分期，能夠更好地反映腫瘤的異質性。目前TNM分期仍是判斷結直腸癌預后最具價值的評價體系，但仍存在不能反映腫瘤異質性的局限性。若將TNM分期與CMS相結合，可對結直腸癌的診斷做出更精準的評估，從而逐漸實現個體化和精準化的結直腸癌診斷與治療。