基于代謝組學研究新生兒黃疸患者及對藍光治療的反應

池敏珊 柯美容 張曉敏

【摘要】 目的：探討新生兒黃疸患者光照前后血清代謝譜學變化，為進一步研究新生兒黃疸和光療反應代謝譜學提高依據。方法：選取本院30例新生兒黃疸患者為新生兒黃疸組，25例健康新生兒為正常對照組。運用核磁共振（NMR）的代謝組學方法來研究生兒黃疸組光療前后與正常對照組的血清代謝譜差異。數據通過多因素的主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進行處理。結果：依據PCA和OPLS-DA模型鑒別，新生兒黃疸組與正常對照組比較有纈氨酸、肌醇、賴氨酸、亮氨酸等10種代謝物存在差異;新生兒黃疸組治療前后有β-葡萄糖、α-葡萄糖、纈氨酸、酪氨酸等28種代謝物存在差異。結論：新生兒黃疸患者的代謝紊亂，且光療對脂質、氨基酸和能量代謝的影響具有重要的作用。

【關鍵詞】 新生兒黃疸; 光療法; 代謝組學; 核磁共振波譜

【Abstract】 Objective：To explore the changes of serum metabolic spectrum in neonatal jaundice patients before and after illumination，and to improve the basis for further study of neonatal jaundice and phototherapy response metabolic spectrum.Method：A total of 30 neonatal jaundice patients were selected as neonatal jaundice group and 25 healthy neonates as normal control group.The metabolomics method of nuclear magnetic resonance（NMR）was used to study the difference of serum metabolic spectrum between Jaundice group and normal control group before and after phototherapy.Data were processed by principal component analysis（PCA）and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）.Result：According to the identification of PCA and OPLS-DA models，there were 10 metabolites such as valine，inositol，lysine and leucine in the neonatal jaundice group compared with the normal control group，there were 28 metabolites such as β-glucose，α-glucose，valine and tyrosine in the neonatal jaundice group before and after treatment.Conclusion：Metabolic disorders in neonatal jaundice patients，and the effects of phototherapy on lipid，amino acid and energy metabolism play an important role.

【Key words】 Neonatal jaundice; Phototherapy; Metabonomics; Nuclear magnetic resonance spectroscopy

First-authors address：Nanshan Peoples Hospital，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.16.003

黃疸是一種新生兒最常見的疾病。據估計，大約60%的足月嬰兒和80%的早產兒在出生后的第1周出現黃疸[1-2]。光療通常被認為是一種安全和耐受性良好的治療新生兒黃疸的方法，可以將膽紅素轉化為水溶性的異構體，很容易通過胃腸道或尿液丟失消除[3-4]。膽紅素在460 nm波長附近的藍色區域吸收最強烈的光，氮化鎵光致發光二極管（LED）可提供高強度的窄波長光譜光，已被越來越多地用于治療新生兒黃疸[5-6]。雖然光療可有效治療新生兒黃疸，但很少有評估光療有效性的生物標志物，2004年美國兒科學會發布的光療指南，主要是參考血清總膽紅素（TSB）水平的高低[7]。標準治療新生兒黃疸是測量TSB水平，常用的化學方法對膽紅素的測量是基于一個偶氮化合物或對膽紅素-膽紅素氧化酶氧化為膽綠素分子氧膽紅素的耦合，但其均受溶血干擾[8]。因此，筆者通過分析新生兒黃疸患者光療前、后的血清的整個代謝譜的變化，進一步闡明光療的作用機理。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年3月-2012年11月本院收治的30例新生兒黃疸患者為新生兒黃疸組，25例健康新生兒為正常對照組。（1）納入標準：胎齡>35周;新生兒黃疸患兒均表現出全身皮膚黏膜黃染和不同程度面目黃染，入院時血清總膽紅素均>15 mg/dL，均以血清未結合膽紅素明顯升高為主。（2）排除標準：新生兒臨床表現為重度黃疸（血清總膽紅素均>25 mg/dL）;新生兒伴有溶血，需要換血（出生時臍血總膽紅素>4 mg/dL）;新生兒血紅蛋白<120 g/L;新生兒伴有水腫、肝脾大和心力衰竭等疾病。患兒監護人均同意參加此項研究，且經本院倫理委員會批準，在整個研究過程中，遵守赫爾辛基主體醫學研究的倫理原則宣言。

1.2 方法 （1）新生兒黃疸組接受光療標準：依據新生兒出生天數和由中華醫學會兒科學會制定的TSB水平[9]。運用頭頂的LED光療系統[Tende Electronics & Software Ltd.Company，Ankara，強度：30～120 μW/（cm2·nm），光譜400～470 nm]進行光療。采集靜脈血，3 000 g離心5 min，收集血清，于-80 °C，用以實驗分析。（2）樣品的核磁共振（NMR）分析：在NMR實驗前，冷凍血清室溫下解凍20 min，離心后取上層血清400 μL并加至5 mm的核磁管中，加入100 μL的生理鹽水（0.9% NaCl 10%/90% H2O和D2O），12 000 g離心5 min，取400 μL等分溶液放入另一個5 mm的核磁共振管用以核磁共振實驗。1H NMR實驗所用儀器是Varian 600譜儀，其1H共振頻率是599.93 Hz。橫向弛豫加權實驗是用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，弛豫延遲2.1 s，采集時間1.000 0 s，譜寬8 000.0 Hz，溫度25 ℃，總回波時間100 ms，累加次數128次。

1.3 觀察指標及評價標準 （1）分析新生兒黃疸藍光治療前后及正常對照組的血清代謝物，血清代謝物的分析運用主成分分析方法（PCA），降低數據的維數和通過主成分分析圖譜，概括核磁共振光譜使用分數間的相似點和不同點。（2）分析新生兒黃疸藍光治療前后及正常對照組代謝物的差異性，對偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）模型進行正交矯正處理，使用SIMCA-P+軟件（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden）進行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），最大化地凸顯模型內部不同組別之間的差異，即判定黃疸藍光治療前后及正常對照的差異[10-11]。

1.4 統計學處理 使用TopSpin軟件（V3.0，Bruker Biospin，Germany）對血清核磁共振譜圖進行傅立葉變換;數據分析使用SIMCA-P 11.0軟件（Umetrics，Umea，Sweden）進行多元統計分析，對檢測獲得的1H NMR譜進行分段積分，并去除水峰及因交叉弛豫引起峰型變寬后，將所產生的所有積分數據歸一化后，對余下的血清譜圖積分譜圖積分分別進行PCA分析;通過OPLS-DA分析各代謝物相應的相關系數（r），對有統計意義的代謝物進行進一步歸納，將每一個變量的系數加載值與其標準偏差的平方根值相乘后進行數據的回溯轉換，然后與相應的r臨界值表進行比對，得到組間差異的代謝物;使用SPSS 11.5軟件（SPSS公司，芝加哥，伊利諾斯州，美國）對所得數據進行統計分析，正態分布計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，非正態分布計量資料用[M（P25，P75）]表示，比較采用秩和檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床和實驗室資料比較 兩組出生體重、孕齡、性別、治療前年齡比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性;新生兒黃疸組治療前總膽紅素濃度高于正常對照組，且治療后總膽紅素濃度低于治療前，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 主成分分析 新生兒黃疸藍光治療前后及正常對照組2D的PCA分析圖顯示，盡管組間存在一些交叉部分，并用交叉驗證后得到的R2X和Q2Y（分別代表模型可解釋的變量和模型的可預測度）對模型有效性進行評判，即R2X=0.824，Q2Y=0.895;Q2Y的預測值為0.807，見圖1。

2.2 正交偏最小二乘判別分析 OPLS-DA圖顯示，對照組和藍光治療前的新生兒黃疸組代謝物質存在差異，其中R2X=0.287，Q2Y=0.843;Q2Y的預測值為0.698，見圖2;新生兒黃疸組藍光治療前后的代謝物質存在差異，其中R2X=0.2238，Q2Y=0.809，Q2Y的預測值為0.753，見圖3;依據r臨界值（|r|>0.330），新生兒黃疸組治療前后有28種代謝物存在差異，新生兒黃疸組治療后β-葡萄糖、α-葡萄糖、纈氨酸、酪氨酸、三甲胺、丙酮酸、磷酸膽堿、肌醇、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘油磷酸膽堿、谷氨酸鹽、丙氨酸、1-甲基組氨酸均低于治療前，乳酸、脂類、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、甘氨酸、谷氨酰胺、丙酮、乙酰乙酸乙酯、3-羥基丁酸酯均高于治療前，見表2;新生兒黃疸組與正常對照組比較有10種代謝物存在差異，新生兒黃疸組治療前纈氨酸、肌醇、賴氨酸、亮氨酸、乳酸、異亮氨酸、甘氨酸、肌酸、丙氨酸高于正常對照組，低密度脂蛋白低于正常對照組，見表2。

3 討論

總膽紅素作為診斷新生兒黃疸的標準和評價藍光治療的效果的一項重要指標[12]，本研究基于NMR實驗的代謝組學研究方法，對藍光治療前后的新生兒黃疸患者的血清進行了分析，并發現了一些新的低分子量的生物標記物。

本研究結果顯示，與正常對照組比較，新生兒黃疸組治療前纈氨酸、肌醇、賴氨酸、亮氨酸、乳酸、異亮氨酸、甘氨酸、肌酸、丙氨酸增加，低密度脂蛋白減少，表明在新生兒黃疸患者血清中的纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和甘氨酸的升高，反映了其氨基酸代謝是紊亂的。眾所周知，乳酸是糖酵解中的終產物，且最近有許多科學家發現在新生兒高黃疸癥患者的乳酸的改變[13]。而肌酸是一種含氮的化合物，其主要在人體的肝臟中合成，作為一個能量調節線粒體和細胞質之間的ATP產量[14]，因此，筆者推測高濃度的肌酸可肝臟細胞功能紊亂。另外，新生兒黃疸患者的血清中的低密度脂蛋白的含量是減少的，早期研究證實，膽紅素具有抗動脈粥樣硬化的特性和與血清中的脂質成分呈負相關[15]。因此，以上提及的代謝組學的發現可以作為診斷新生兒黃疸重要生物標記物。

本研究結果顯示，新生兒黃疸患者接受藍光治療前后共有28種代謝物質發現差異性的改變，13種代謝物質變化是增加的，其中乳酸和脂質變化顯著，另有15種代謝物質是變化是減少的，其中糖和氨基酸的變化顯著，大多數的代謝物質主要與氨基酸和糖代謝相關，藍光治療后的新生兒黃疸患者血清中，β-葡萄糖和α-葡萄糖的含量均是明顯減少的（r=-0.666、-0.658），這一結果充分說明了藍光治療會直接影響新生兒黃疸患者的能量代謝，而健康嬰兒的代謝變化沒有發生改變，此研究的結果是一定的探索性。因此，藍光治療組的代謝變化可能與后天成熟或喂養的結果有關。

一項早期研究發現，新生兒黃疸患者接受藍光治療后，其血流會增加，這可能與消耗能量和葡萄糖的水平下降有關[16]。這就更好地解釋了新生兒黃疸患者在接受藍光治療后，其血清中β-葡萄糖和α-葡萄糖的水平下降的原因。本研究結果顯示，丙酮酸水平減少（r=-0.346）、乳酸水平增加（r=0.599），乳酸是糖酵解的終產物，而丙酮酸是在糖酵解階段產生乳酸前的一個中間產物，當機體急需要能量時，丙酮酸可以通過糖酵解途徑產生更多的ATP能量，這樣導致產生了更多的乳酸。另一方面，在嬰幼兒時期，機體具有維持糖自穩的重要能力[17-18]，以上提及的代謝組學特性顯示藍光治療新生兒黃疸患者可以導致其β-葡萄糖和α-葡萄糖的水平下降，從而引起新生兒機體增加糖異生來維持血糖水平。本研究中，生糖氨基酸包括纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸的降低，筆者推測這些氨基酸為轉化葡萄糖來維持血糖平衡。此外，作為葡萄糖的異構體，肌醇的含量保持一個較低的水平。因此，筆者認為光療不僅能加速膽紅素的代謝，而且能導致糖代謝的改變。

本研究還顯示，患兒治療后的血脂水平（如低密度脂蛋白）在光療后顯著升高，與Yoshino等[19]研究一致，說明總膽紅素與低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白呈負關聯的。在本研究中，顯著降低的血脂如低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白，考慮為新生兒黃疸光療后的患者可能通過光動力應激可引起脂質過氧化作用。然而，謝輝等[20]觀察膽紅素水平與HDL-C水平呈正相關，但筆者沒有觀察到在藍光治療后的高密度脂蛋白的顯著性變化，這可能是由于本研究中的樣本數少有關。

膽紅素暴露在光下，可以轉化為水溶性異構體。然而，異構體的代謝具體機制目前沿不清楚。在本研究中，筆者采用基于NMR的代謝組學方法研究新生兒黃疸患者血清代謝譜分析，顯著性差異的代謝物可能對闡明的光療作用的詳細機制和用以診斷和監測治療新生兒黃疸患者提供了重要的生物標志物，而關于健康嬰兒后續檢測需要更多的相關研究。

綜上所述，新生兒黃疸患者的代謝紊亂，且光療對脂質、氨基酸和能量代謝的影響具有重要的作用。

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（收稿日期：2018-05-18） （本文編輯：董悅）