一測多評法同時測定竭紅跌打酊中5種成分的含量

趙 華，茅建輝

0 引言

竭紅跌打酊處方源于衛生部頒藥品標準中藥成方制劑第十四冊，是由紅花、兒茶、蘇木、當歸尾、白礬等10味中藥材提取加工而成的中成藥復方制劑，具有散瘀消腫、活絡止痛的功效，主要用于跌傷、筋骨扭傷、積瘀腫痛等病癥的治療[1]。現行質量標準未對竭紅跌打酊方中任何成分進行定量測定，也未檢索到對該制劑進行含量測定的文獻報道。隨著國家對中醫藥監管的力度不斷加大，多成分定量測定已逐漸成為中成藥復方制劑常用的質量評價模式，一測多評法利用中成藥復方制劑中所含成分內在的函數和比例關系，通過測定其中一個代表性成分(易得、穩定、廉價、有效)，建立其他成分與該成分間的相對校正因子，達到同時測定中成藥復方制劑中多成分含量的目的，有效地解決了多成分同時測定檢驗成本高、操作繁瑣等不足，一測多評法已成為中成藥復方制劑質量評價的發展趨勢。為全面有效地控制竭紅跌打酊的產品質量，本文以竭紅跌打酊中主要藥味紅花、兒茶和蘇木為研究對象，選取兒茶素為內標物，建立兒茶素與羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B之間的相對校正因子，并計算其含量，探討一測多評法對竭紅跌打酊中5種成分同時定量測定的可行性及準確性。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；竭紅跌打酊(規格：300 ml/瓶；批號：170085、170092、180013)來源于國藥集團馮了性(佛山)藥業有限公司；羥基紅花黃色素A對照品(批號：111637-201810，含量：93.1%)、兒茶素對照品(批號：110877-201604，含量：99.2%)、表兒茶素對照品(批號：110878-201703，含量：99.7%)、(±)原蘇木素B對照品(批號：111882-201302，含量：89.9%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；巴西蘇木素對照品(批號：474-07-7，含量：98.0%)來源于上海純優生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脫(0～13.0 min，10.0%A；13.0～19.0 min，10.0%A→15.0%A；19.0～31.0 min，15.0%A→22.0%A；31.0～43.0 min，22.0%A→36.0%A；43.0～50.0 min，36.0%A→10.0%A)；0～19.0 min時在403 nm[2-5]波長下檢測羥基紅花黃色素A，19.0～50.0 min在280 nm[2,6-9]波長下檢測兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B；流速：0.9 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B對照品各適量，用80%甲醇分別制成每1 ml含0.698、1.012、0.576、0.382、0.218 mg的對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品溶液 依次精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品儲備液各2.5 ml，用80%甲醇[10]制成羥基紅花黃色素A 0.034 9 mg/ml、兒茶素0.050 6 mg/ml、表兒茶素0.028 8 mg/ml、巴西蘇木素0.019 1 mg/ml、(±)原蘇木素B 0.010 9 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.3 線性考察混標溶液 依次精密吸取“2.2.1”項下制備的對照品儲備液各2.0 ml，置于同一10 ml量瓶中，搖勻，作為線性考察混標溶液Ⅰ，再精密吸取線性考察混標溶液Ⅰ各適量，依次用80%甲醇稀釋2、4、8、16、20倍，分別制成線性考察混標溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。

2.2.4 竭紅跌打酊供試品溶液 精密量取竭紅跌打酊1.0 ml，置25 ml量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成竭紅跌打酊供試品溶液。

2.2.5 陰性樣品溶液 按竭紅跌打酊質量標準項下的處方和制備工藝，分別制備不含紅花的陰性樣品、不含兒茶的陰性樣品和不含蘇木的的陰性樣品，分別按照“2.2.4”項下所述的竭紅跌打酊供試品溶液制備方法制成相應的3種陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性與專屬性試驗 精密吸取混合對照品溶液、竭紅跌打酊供試品溶液、紅花陰性樣品溶液、兒茶陰性樣品溶液和蘇木陰性樣品溶液各適量，依法進樣測定，結果見圖1。所測色譜峰羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B與其相鄰色譜峰能達到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數以所測各成分色譜峰計均大于4 500，陰性樣品對測定無干擾。

2.3.2 標準曲線的考察 精密吸取“2.2.3”項下制備的線性考察混標溶液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各適量，分別依法進樣檢測，記錄羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B峰面積，以質量濃度X為橫坐標，羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程，結果見表1。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.2”項下的混合對照品溶液，連續進樣6次，記錄羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B峰面積，結果所測5個成分峰面積的RSD分別為1.01%、0.66%、1.09%、1.14%、1.23%。

圖1 色譜圖

注：A.混合對照品，B.竭紅跌打酊，C.紅花陰性樣品，D.兒茶陰性樣品，E.蘇木陰性樣品；1.羥基紅花黃色素A，2.兒茶素，3.表兒茶

素，4.巴西蘇木素，5.(±)原蘇木素B

2.3.4 重現性試驗 取同一批次竭紅跌打酊，按照“2.2.4”項下竭紅跌打酊供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進樣測定，分別計算羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的含量，結果顯示，所測組分羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量的RSD依次為1.42%、1.35%、0.51%、1.72%和0.84%。

2.3.5 穩定性試驗 取同一批次竭紅跌打酊樣品的同一份供試品溶液，分別于室溫下0、2、4、6、12、16、24 h進樣檢測，記錄羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的峰面積，結果表明，竭紅跌打酊供試品溶液在室溫下24 h內穩定，峰面積RSD分別為0.98%、0.59%、1.05%、1.08%、1.19%。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的竭紅跌打酊適量，分別精密量取0.5，分置不同的25 ml量瓶中，依次精密加入羥基紅花黃色素A對照品溶液(0.374 mg/ml)、兒茶素對照品溶液(0.569 mg/ml)、表兒茶素對照品溶液(0.307 mg/ml)、巴西蘇木素對照品溶液(0.215 mg/ml)和(±)原蘇木素B對照品溶液(0.133 mg/ml)0.5、1.0、1.5 ml，按照“2.2.4”項下竭紅跌打酊供試品溶液制備方法制備加樣供試品溶液，依次進樣測定，結果所測成分羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的平均加樣回收率見表2。

2.4 相對校正因子(fk/s)的計算 精密吸取“2.2.3”項下制備的線性考察混標溶液Ⅵ、Ⅴ、Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ各適量，依法進樣測定羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的峰面積，以兒茶素為內標物，按照相對校正因子計算公式fk/s=(WkAs)/(WsAk)(式中W為所測成分質量濃度，A為所測成分峰面積，k為內標物，s為其他待測成分)分別計算內標物與羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的相對校正因子，結果見表3。

表2 羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的回收率

表3 以兒茶素為內標的相對校正因子

2.5 相對校正因子的重復性考察 取“2.2.2”項下制備的混合對照品溶液分別進樣測定，考察Agilent 1260型高效液相色譜儀、Waters 2695型液相色譜儀和Agilent Zorbax SB-C18色譜柱、Kromasil C18色譜柱、Hypersil ODS C18色譜柱對相對校正因子的影響，按照相對校正因子計算公式fk/s=(WkAs)/(WsAk)(式中W為所測成分質量濃度，A為所測成分峰面積，k為內標物，s為其他待測成分)計算相對校正因子，結果見表4。試驗結果表明，不同儀器與不同色譜柱對所測成分羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的相對校正因子無顯著影響。

表4 各因素對相對校正因子的影響

2.6 待測成分色譜峰定位 保證所建立的相對校正因子得以準確應用的前提條件是色譜峰的準確定位。以表兒茶素為內標物，采用相對保留值法考察在不同儀器、不同色譜柱條件下羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B與內標物兒茶素的相對保留值。實驗結果表明,不同儀器、不同色譜柱條件下，羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B與內標物兒茶素的相對保留值無明顯差異，結果見表5。

3 樣品測定

取3批竭紅跌打酊，批號為170085、170092、180013，分別采用外標法和一測多評法測定竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的含量，結果見表6。實驗結果表明,外標法所測結果和一測多評法計算結果無顯著差異，相對校正因子可信度較高，所建立的一測多評法可用于竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量的同時測定。

4 討論

4.1 流動相的選擇 流動相對色譜峰具有明顯的影響，通過比較所測各成分羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B色譜峰的峰形、分離度及保留時間，筆者對比考察了甲醇-水流動相體系、乙腈-水流動相體系[10]、乙腈-0.2%磷酸溶液流動相體系[4-5]、乙腈-0.2%冰醋酸溶液流動相體系[9]和乙腈-0.2%甲酸溶液流動相體系[3,11]，優選最佳的流動相體系為乙腈-0.2%磷酸溶液流動相體系。在此實驗基礎上，通過對乙腈與0.2%磷酸溶液流動相比例的不斷摸索和對比試驗，最終確定以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，按照文中“2.1”項下的梯度洗脫比例實現對竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量的同時測定。

4.2 待測成分的選擇及內標物的確定 竭紅跌打酊是由紅花、兒茶、蘇木、當歸尾、白礬等10味中藥材加工而成的中成藥復方制劑，所含成分復雜，具有多成分多靶點的作用特點，紅花、蘇木、當歸尾活血散瘀、消腫止痛，為方中君藥；附以乳香、沒藥、血竭祛瘀止痛、消腫生肌，兒茶、白礬收斂止血，蘆薈清熱散瘀，安息香行氣活血，諸藥合用，共成散瘀消腫、活絡止痛之效。根據中藥質量標志物確定原則，以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥的原則，本文選取竭紅跌打酊中主要藥味紅花的代表性成分羥基紅花黃色素A、蘇木的代表性成分巴西蘇木素和(±)原蘇木素B、兒茶的代表性成分兒茶素和表兒茶素為檢測指標，同時選取對照品穩定、價格較低的兒茶素為內標物，通過建立內標物兒茶素與羥基紅花黃色素A、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B的相對校正因子，實現一測多評法對竭紅跌打酊中多指標成分的同時測定。

表5 各因素對相對保留值的影響

表6 含量測定結果(n=3，mg/ml)

5 小結

本實驗建立的一測多評法同時測定竭紅跌打酊中羥基紅花黃色素A、兒茶素、表兒茶素、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B含量具有操作便捷、結果準確、專屬性強、重復性好等優點，有效地解決了多成分同時測定質量評價模式檢驗成本高的問題，為提高和修訂竭紅跌打酊的質量標準提供了實驗數據。