高效液相色譜-串聯質譜法測定人血漿中色氨酸及其代謝物濃度

劉儀濱，陳 慧，朱 茜，賴偉華，楊 敏，鐘詩龍*

0 引言

色氨酸(Tryptophan，TRP)是一種人體必需氨基酸，參與蛋白質合成，是多種重要生物活性分子的前體物質。色氨酸代謝保持穩態平衡對機體健康有重要意義。色氨酸在體內主要有3條代謝途徑[1]：①犬尿氨酸途徑產生犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)及犬尿喹啉酸(Kynurenic acid，KYNA)等；②5-羥色胺途徑；③腸道細菌降解途徑生成吲哚以及含吲哚環的化合物如吲哚丙酸(Indole-3-propionic acid，IPA)[2]。研究表明，在心血管疾病患者中，色氨酸代謝出現失衡，如KYN代謝途徑的增強會增加心血管疾病發生風險[3]，血漿中低濃度的TRP、高濃度的KYN、KYNA與患者死亡和心血管事件風險增加顯著相關[4-6]。犬尿氨酸類代謝物參與患者的免疫調節和血管擴張，是心血管疾病發生發展中關鍵的病理機制之一[7]。此外，色氨酸經生孢梭菌(Clostridium sporogenes)作用所生成的IPA是一種抗氧化劑和氫氧自由基清除劑，血漿中IPA降低與糖尿病和晚期動脈粥樣硬化的發生有關[8-9]。此外，研究表明，IPA可減少神經元細胞的DNA損害和脂質過氧化，具有神經保護作用[10]?？梢?，色氨酸代謝途徑在冠心病的發生發展中可能有著重要作用，而對色氨酸及其代謝物進行準確定量分析是對其深入研究的必要前提。

目前，國內外有多種同時測定血漿中色氨酸及其代謝物的報道，多用色譜方法與質譜分析聯用，這是由于色譜具有強大的分離能力和對物質結構的解析鑒定能力。然而，一些已報道的方法存在一定局限性：①分析生物樣品中內源性物質時，難以找到與之相對應的空白基質，使內源性化合物難以準確定量；采用有機溶劑[11]、含4%BSA的PBS緩沖鹽溶液作為替代基質[12]，均與血清等復雜生物基質存在一定的偏差。②測定基質效應時采用背景扣除法[11]，不適用于樣本中內源性代謝物本底值很高的情況。

基于此，本研究在以往研究的基礎上，建立了同時準確定量人體血漿中色氨酸及其代謝物犬尿氨酸、犬尿喹啉酸和吲哚丙酸的方法，并將其應用于檢測冠心病患者血漿中色氨酸及其代謝物水平。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 L-色氨酸，純度：99%，百靈威科技有限公司。L-犬尿氨酸水合物，純度：>98.0%(T)，Aladdin。犬尿喹啉酸，純度：99%，美國Sigma-Aldrich。3-吲哚丙酸，純度：98%，百靈威科技有限公司。色氨酸-d5，純度：98%，Toronto Research Chemicals。活性炭，100目，美國Sigma-Aldrich。甲醇，色譜純，德國Merck公司。二甲基亞砜，分析純，天津市北聯化工品開發有限公司。甲酸：分析純，美國Sigma-Aldrich。醋酸銨，色譜純，美國Sigma-Aldrich。實驗用水經超純水儀(EMD Millipore，Billerica，美國)處理所得。API4000 QTrap 三重四極桿質譜儀(AB Sciex，美國)，LC-20A高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)。

1.2 受試者選擇 本方案經廣東省人民醫院倫理委員會批準。所有受試者均簽署知情同意書。共入選90例冠心病患者，男77例，女13例，年齡(61.30±10.57)歲。入選標準：經冠脈造影診斷狹窄程度大于50%；并行PCI術的患者。排除標準：年齡>80歲，肝功能異常(丙氨酸氨基轉移酶>120 U/L)，腎功能異常(血清肌酸酐>345 μmol/L)。

1.3 血漿樣本采集 于清晨空腹下采集研究對象的靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，于4 ℃ 低溫，以3 000 r/min離心10 min，收集上層血漿，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 流動相為含0.2%甲酸和5 mmol/L醋酸銨的超純水與甲醇(v/v，45/55)；洗脫方式為等度洗脫；流速為0.3 ml/min；柱溫為40 ℃；色譜柱采用Ultimate XB-C18HPLC柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)；進樣量為4 μl；分析時間共3 min。

1.4.2 質譜條件 采用正離子電噴霧電離(ESI)模式，多反應監測(MRM)模式監測，電噴霧電壓(IS)為5 500 V；氣簾氣壓力(CUR)為25 psi；霧化氣壓力(GS1)為50 psi；輔助氣壓力(GS2)為50 psi；離子源溫度(TEM)為550 ℃。多反應監測(MRM)模式監測反應質荷比(m/z)：色氨酸(205.1→146.1)，犬尿氨酸(209.1→94.1)，犬尿喹啉酸(190.1→144.1)，吲哚丙酸(190.4→129.7)，色氨酸-d5(210.3→192.2)。色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸及內標色氨酸-d5的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)參數見表1。

表1 色氨酸及其代謝物及內標的最佳質譜參數

注：DP，Declustering Potential;CE，Collison Energy;TRP，L-tryptophan;KYN，L-kynurenine;KYNA，kynurenic acid;IPA，3-indolepropionic acid;IS，internal standard;TRP-d5，tryptophan-d5。下同

1.4.3 標準溶液與內標溶液的制備 取色氨酸、犬尿氨酸、吲哚丙酸對照品適量，精密稱定后分別加甲醇配制成1 mg/ml的儲備液。取犬尿喹啉酸對照品適量，精密稱定后加甲醇/DMSO(v/v，90/10)，配制成20 μg/ml儲備液。取色氨酸-d5對照品適量，精密稱定后加甲醇配制成200 μg/ml的儲備液作為內標物，使用時用甲醇進行稀釋，配制色氨酸-d5質量濃度為20 μg/ml的內標溶液。所有溶液避光保存于-20 ℃下。

1.4.4 血漿樣品預處理 取50 μl的血漿，置于1.5 ml EP管中，加入20 μg/ml色氨酸-d5內標溶液10 μl，再加入150 μl冰冷的甲醇/乙腈(v/v，50/50)沉淀蛋白，渦旋混合5 min后，于-20 ℃下放置20 min使蛋白沉淀完全。于4 ℃，14 000 r/min下離心15 min，取上清液100 μl到96孔板中，進行LC-MS/MS分析。

1.4.5 空白血漿的制備 取10 ml血漿加入1.0 g活性炭，冰浴條件下用磁力攪拌器攪拌6 h后，低溫4 ℃下，14 000 r/min離心15 min后取上清液，再經由0.22 μm微孔濾膜過濾2次，得到空白血漿。血漿樣本來自于健康志愿者。

1.5 方法學驗證

1.5.1 專屬性 分別取50 μl空白血漿，按“血漿樣本預處理”項操作，得空白血漿色譜圖。取空白血漿40 μl加入含4個物質的混合對照品溶液10 μl，渦旋后，按“1.4.4”項操作處理血漿，得分析物色譜圖。

1.5.2 標準曲線和定量下限 取空白血漿40 μl，分別加入色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸的混合對照品工作液10 μl，配制成色氨酸質量濃度分別為100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 ng/ml，犬尿氨酸質量濃度分別為25、50、125、250、500、1 250、2 500、5 000 ng/ml，犬尿喹啉酸質量濃度分別為5、10、25、50、100、250、500、100 ng/ml，吲哚丙酸質量濃度分別為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/ml的含藥血漿樣品，按“1.4.4”項操作。分別以待測物的質量濃度為橫坐標x，以藥物與內標峰面積的比值為縱坐標y，用加權最小二乘法進行線性回歸分析(權重系數為1/x2)。

1.5.3 精密度和準確度 取空白血漿40 μl，分別加入含4個待測物的最低定量限(LLOQ)、低、中、高4個濃度的對照品工作液各10 μl，制成色氨酸質量濃度分別為100、200、2 000、15 000 ng/ml，犬尿氨酸質量濃度分別為25、50、500、3 750 ng/ml，犬尿喹啉酸質量濃度分別為5、10、100、750 ng/ml，吲哚丙酸質量濃度分別為10、20、200、1 500 ng/ml的質控血漿樣品，按“1.4.4”項操作。每種質量濃度各平行6次，連續測定3 d。根據當日的標準曲線，計算質控樣品的測定濃度。精密度通過測量值的相對標準偏差(RSD)來判定；準確度通過相對誤差(RE)=(測量值-真實值/真實值)×100%來判定。

1.5.4 提取回收率和基質效應 分別考察低、中、高3種濃度質控血漿樣品的回收率和基質效應，每種濃度平行制備6份樣本，且每份樣本所用的空白血漿分別來自6個不同健康志愿者。分別配制含色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸的低、中、高3種質量濃度的質控血漿樣品，按“1.4.4”項操作，得到峰面積A；將空白血漿按“1.4.4”項進行前處理，取上清液，分別加入色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸的混合對照品溶液配制成低、中、高3種濃度的質控樣品，加入內標工作液，渦旋混勻后，進樣分析得峰面積B；色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸的混合對照品溶液用純溶液甲醇/水(v/v，50/50)配制成低、中、高3種濃度的質控樣品，加入內標工作液，進樣分析得到峰面積C。提取回收率=A/B×100%，絕對基質效應=B/C×100%，IS-校正基質效應=分析物-絕對基質效應/IS-絕對基質效應。

1.5.5 穩定性 分別考察低、中、高3種濃度的含藥血漿樣品，分別考察在室溫放置8、24 h內，于-80 ℃反復凍融3次和進樣器中放置19 h條件下的穩定性。每種濃度樣品平行6次。

2 結果

2.1 方法學評價

2.1.1 專屬性 色氨酸及其代謝物在正離子模式下的信號強于負離子模式下的信號，故采用正離子模式掃描。在全掃描模式下，將[M+H]+確定為母離子，根據強的豐度和基質對其干擾小的原則選擇定量子離子，采用多反應檢測(MRM)模式同時定性檢測5種物質的母離子和子離子，經過多次掃描，選定定量離子對205.1→146.1(TRP)，209.1→94.1(KYN)，190.1→144.1(KYNA)，190.4→129.7(IPA)，210.3→192.2(TRP-d5),其二級掃描質譜圖如圖1所示。在該條件下，分別得空白血漿、空白血漿+對照品溶液的色譜圖，如圖2所示。TRP、KYN、KYNA、IPA以及內標TRP-d5保留時間分別為1.07、1.03、1.24、2.39、1.06 min，峰形良好，目標化合物和內標物出峰處不受雜質或血漿中內源性物質干擾，顯示出該方法條件下5種分析物的特異性好。

圖1 各化合物結構式及其二級全掃描質譜圖

圖2 各化合物色譜圖

2.1.2 標準曲線和定量下限 色氨酸的標準曲線為y=1.18×10-3x-1.83×10-2(r=0.998 9)，線性范圍為100～20 000 ng/ml；犬尿氨酸y=5.54×10-4x-1.7×10-3(r=0.999 0)，線性范圍為25～5 000 ng/ml；犬尿喹啉酸y=2.37×10-2x+4.52×10-2(r=0.998 4)，線性范圍為5～1 000 ng/ml；吲哚丙酸y=1.52×10-2x-5.12×10-3(r=0.999 5)，線性范圍為10～2 000 ng/ml。

2.1.3 精密度和準確度 LLOQ的色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸質控樣品的日內、日間精密度(RSD)均小于20%，準確度(RE)滿足±20%的要求；低、中、高3種濃度的色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸 質控樣品的日內、日間精密度(RSD)均小于15%，表明重復性良好，相對誤差(RE)滿足±15%的要求，表明準確度良好。結果見表2。

表2 定量分析血漿色氨酸及其代謝物犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸的精密度、準確度和提取回收率(%)

2.1.4 提取回收率和基質效應 分別考察4種分析物低、中、高3種濃度質控樣品和內標物的提取回收率和基質效應。結果顯示，TRP、KYN、KYNA、IPA的平均提取回收率分別為94.35%、98.88%、97.33%、97.64%，回收率均>90%。6份不同來源樣本之間低、中、高3個濃度的TRP、KYN、KYNA和IPA的平均絕對基質效應分別為88.19%±4.97%、79.85%±7.93%、798.93%±82.58%、106.23%±4.09%，CV均<15；6份不同來源樣本之間IS-校正基質效應平均值分別為105.56%±4.69%、95.45%±4.33%、953.87%±60.48%%、127.43%±9.05%，CV均<15%。內標色氨酸-d5的平均回收率108.40%，CV為1.08%；平均基質效應83.55%，CV為6.39%。提取回收率結果見表2，基質效應結果見表3。

2.1.5 穩定性 結果表明，低、中、高3種濃度的色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸質控樣品在室溫放置8 h，RSD在2.49%～11.77%；24 h內反復凍融3次，RSD在2.23%～8.41%；在自動進樣器內放置19 h，RSD在1.17%～11.47%，穩定性良好。結果見表4。

2.2 方法學的應用 用本文建立的LC-MS/MS方法測定90例冠心病患者于清晨空腹下采集得血漿樣本中色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸和吲哚丙酸的濃度。測得血漿中色氨酸濃度為(9 466.64±1 947.95) ng/ml，犬尿氨酸濃度為(427.03±127.86) ng/ml，犬尿喹啉酸濃度為(11.50±3.44) ng/ml，吲哚丙酸濃度為(439.88±375.69) ng/ml。色氨酸、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸以及吲哚丙酸在血漿中的濃度分布情況，見圖3。

表3 血漿中色氨酸及其代謝物犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸的基質效應

表4 血漿中色氨酸及其代謝物犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚丙酸的穩定性(%)

圖3 90例冠心病患者血漿濃度分布圖

3 討論

本研究采用高效液相色譜-串聯質譜法建立了一種簡單、快速、靈敏、血漿消耗量少的準確定量測定色氨酸及其代謝產物犬尿氨酸、犬尿喹啉酸和吲哚丙酸的方法，該方法成功應用于測定90例冠心病患者血漿中色氨酸其代謝物的血漿濃度。

3.1 生物樣本前處理及分析時間 本研究樣品前處理操作簡便，分析時間短，具有高通量的優勢，有利于大樣本量的測定。使用甲醇/乙腈(v/v，50/50)沉淀血漿中的蛋白，并在-20 ℃放置一定時間使蛋白沉淀更為完全，樣品處理步驟簡便，效率高，靈敏度滿足分析要求，重現性好。色氨酸及其3種代謝物全部出峰時間僅為3 min，峰形良好且無內源性雜質干擾，特異性良好。在4個待測物中，吲哚丙酸在人血漿中的分析方法及應用目前報道較少。

3.2 內標物的選擇 本研究選用氘代色氨酸作為內標物，一定程度上校正基質效應，以提高定量分析的準確性和重現性。與其他和待分析物結構相似的內標物相比，同位素標記的內標物有著和待分析物相同的化學性質，干擾基質對它們的離子化影響相近，能夠最小化穩定性、提取回收率或離子化效率所帶來的問題[13]。然而，這種方法的主要缺點是同位素標記的內標成本高昂和最合適的同位素標記的內標物難以獲得。因為色氨酸及其代謝物在化學結構上具有一定的相似性，故使用氘代色氨酸作為內標物，可在一定程度上減少樣品前處理以及離子化過程造成的誤差。

3.3 色譜條件的選擇 在水-甲醇的流動相中加甲酸和醋酸銨，以維持體系處于酸性條件下，可獲得良好的峰形，并增加待測物的離子化從而提高響應。選擇流動相時，以乙腈和水作為流動相時，各分析物的響應不如以甲醇和水為流動相好，且峰形較寬。色氨酸及其代謝物雖然有著不同的物理化學性質(不同的親水性或親脂性)，但相同之處在于所有的分子都是相對疏水的結構，都包含吲哚環或是苯環結構，不同的官能團(羧基、羥基、氨基)改善了分子的親水性，并且有助于其離子化，使得質譜響應提高[14]。因此，流動相的pH值對于分子的保留行為是一個很重要的因素?；诖?，采用在水-甲醇的流動相中加甲酸(0.2%)和醋酸銨(5 mmol/L)以維持體系處于酸性條件下(pH值為2～3)，峰型良好。甲酸的加入使得各物質保留時間稍延長，且各物質分離效果更好，并在一定程度上增加離子化。

3.4 空白基質的選擇及基質效應 采用“活性炭吸附法”，吸附除去血漿中內源性的色氨酸及其代謝物，使基質更接近原生物基質，使其成為替代基質用于構建標準曲線，提高定量分析結果的準確性。因為色氨酸及其代謝物屬于血漿中的內源性物質，難以找到與之相對應的空白基質。文獻報道的血漿的替代基質有純水、有機溶劑、含4%BSA的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液、活性炭吸附處理后的基質等[15]。犬尿喹啉酸在本實驗條件下有基質增強效應，但是在6份來自不同健康志愿者的血漿樣本中基質效應結果均顯示增大(CV<15%)，且低、中、高3種濃度之間的絕對基質效應和內標歸一化基質效應的CV均小于15%，符合《生物樣品分析方法驗證指南》和《中國藥典》2015版第4部通則9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則所規定的6批基質計算的內標歸一化的基質因子的變異系數不得大于15%的要求[16]，因而該方法能夠應用于血漿樣本中犬尿喹啉酸的濃度水平的分析。

3.5 色氨酸及其代謝物的血漿濃度測定 與文獻報道的測定值相比[17-18]，色氨酸和犬尿氨酸的測定結果與報道值接近；犬尿喹啉酸測定結果則偏高，一方面可能是實驗條件的不同(空白基質和內標物的選用、樣品的前處理、標準曲線的構建等)，另一方面可能是受試者疾病狀態和總樣本量的不同，導致測定結果的差異。在冠心病患者群體中，吲哚丙酸的血漿濃度水平分布離散，個體差異性較大。

本方法可用于人血漿中色氨酸及其代謝物犬尿氨酸、犬尿喹啉酸和吲哚丙酸的定量分析，探究色氨酸及其代謝物的動態變化規律與生物過程的聯系，對于有效靶點標志物的尋找、相關疾病的診斷、病情監測等方面具有重要意義。